GB-4789.2-2016-食品安全国家标准-食品微生物学检验-菌落总数测定

中华人民共和国国家标准GB4789.2—2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.2—2016Ⅰ前言本标准代替GB4789.2—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。GB4789.2—20161食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定1范围本标准规定了食品中菌落总数(Aerobicplatecount)的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。2术语和定义菌落总数aerobicplatecount食品检样经过处理,在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后,所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1恒温培养箱:36℃±1℃,30℃±1℃。3.2冰箱:2℃~5℃。3.3恒温水浴箱:46℃±1℃。3.4天平:感量为0.1g。3.5均质器。3.6振荡器。3.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。3.8无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。3.9无菌培养皿:直径90mm。3.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。3.11放大镜或/和菌落计数器。4培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基:见A.1。4.2磷酸盐缓冲液:见A.2。4.3无菌生理盐水:见A.3。5检验程序菌落总数的检验程序见图1。GB4789.2—20162图1菌落总数的检验程序6操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品:称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。6.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。6.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其GB4789.2—20163混合均匀,制成1∶100的样品匀液。6.1.4按6.1.3操作,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管或吸头。6.1.5根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。6.2培养6.2.1待琼脂凝固后,将平板翻转,36℃±1培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。6.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL),凝固后翻转平板,按6.2.1条件进行培养。6.3菌落计数6.3.1可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。6.3.2选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。6.3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。7结果与报告7.1菌落总数的计算方法7.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。7.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N=􀰐C(n1+0.1n2)d……………………(1)式中:N———样品中菌落数;􀰐C———平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1———第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2———第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d———稀释因子(第一稀释度)。示例:稀释度1∶100(第一稀释度)1∶1000(第二稀释度)菌落数(CFU)232,24433,35GB4789.2—20164N=􀰐C(n1+0.1n2)d=232+244+33+35[2+(0.1×2)]×10-2=5440.022=24727上述数据按7.2.2数字修约后,表示为25000或2.5×104。7.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2菌落总数的报告7.2.1菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。7.2.2菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。7.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。7.2.4若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。7.2.5称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。GB4789.2—20165附录A培养基和试剂A.1平板计数琼脂(platecountagar,PCA)培养基A.1.1成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLA.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.0±0.2。分装试管或锥形瓶,121℃高压灭菌15min。A.2磷酸盐缓冲液A.2.1成分磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g蒸馏水500mLA.2.2制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。A.3无菌生理盐水A.3.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mLA.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。