第13讲-蛋白质组分析

第十三讲蛋白质组数据分析2016-05-20本章内容9.1二维凝胶电泳数据分析9.2蛋白质质谱数据分析9.3蛋白质互作生物信息学9.4分析细胞通路的生物信息学方法Whyproteomics？Proteomics1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。“...theanalysisofcompletecomplementofproteins.Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.(StanleyFields,UniversityofWashington,Seattle,inScience,291,1221(2001))整体性、动态性和系统性Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域aeukaryoticCell蛋白质组学(proteomics)Biology/Disease-drivenHPP蛋白质组学研究范畴蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定蛋白质结构分析蛋白质--蛋白质生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库蛋白质组学应用举例研究细胞结果功能和分子组成发现新的药物靶位点发现新型生物学活性的分子和药物差异蛋白质组学发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物修饰蛋白质组学遗传或药理学扰动的分子解剖病理生理学研究中药机理相互作用蛋白质组学研究药物作用方式和毒性机理植物抗虫抗旱抗逆遗传育种和分子育种资源环境海洋生物寻找差异蛋白质环孢素A处理前环孢素A处理后正常组织肿瘤组织细胞组织Initialgoalwastorapidlyidentifyalltheproteinsexpressedbyacellortissue–agoalthathasyettobeachievedforanyspecies!蛋白质组学比基因组学研究复杂蛋白质数量大于基因数蛋白质是动态的蛋白质序列复杂，不能PCR扩增，不能自动化测序GenomicDNAmRNABiologicalsystemFunctionalproteinProteinproductstechnologyemergingprototypematuresequencingExpressionprofileStructuraldeterminationProteinlinkagemap(catalog)QuantitativeproteinprofileProteinlinkagemap(dynamic)SubcellularlocationPosttranslationalModificationanalysisActivityprofileSystemsimulationDataintegrationcurrentstatusofproteomictechnologiesBasictechnologiesofProteomics2-Delectrophoresisofcomplexproteinmixtures：ThecoretechnologyofproteomicsIdentificationandstructureanalysisofproteinswithmassspectrometrymethods（生物质谱：ESI-MS,MALDI-TOF-MS）酵母双杂交Bioinformatics生物信息学在蛋白质组学中的应用生物信息学在蛋白质组学中的应用1二维凝胶电泳数据分析小鼠肝脏蛋白提取物2D凝胶电泳2-DelectrophoresisgelfromProf.Dr.A.Görg,TechnicalUniversityMunich,Germany样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGEelectrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Softwareanalysis）质谱鉴定（Proteinidentification）双向电泳实验流程细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量差异分析双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染考染荧光蛋白标记样品制备分离染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程样品制备细胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除核酸、脂类差异分析图像获取图谱分析银染考染荧光蛋白标记染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞Separation双向电泳第一向第二向细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程双向电泳：传统方法sample胶在SDS缓冲液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直胶管中进行等电聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝胶电泳非连续梯度胶按等电点分离（电荷）按分子量分离（质量）等电聚焦电泳原理固相凝胶(支持膜上0.5mm厚凝胶)丙烯酰胺缓冲液:Immobiline®CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度平衡过程2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程差异分析图像获取图谱分析蛋白标记图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向银染考染荧光染色ProteinDetectionMethodsSensitivitylimitQuantitationLivingcellsLinearDynamicRangeCoomassieBluestaining100ng+++no3Negativestaining15ng+no3Silverstaining200pg+no7Fluorescentstaining400pg++++no104Fluorescentlabelling250pg++++no104Radioactivelabeling:X-rayfilm1pg+++yes20Phospor-imagerplates0.2pg++++yes105Stableisotopelabelling1pg++++(withMS)yes?Coomassie™Blue-考马斯亮蓝染色灵敏度，低至0.01mg(“胶体”考染)非特异性染色染料与蛋白成比例结合线性化好-扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度-纯度不够-有限的动力学范围胶体考马斯亮蓝染色1mgE.colistrainBIPGphor24cmpH4-7ColloidalCBBG250staining银染灵敏度，低至0.2ng在凝胶基质中与蛋白交联自动催化反应-染凝胶表面蛋白-线性化程度比考染低-一些大分子物质也被染色-步骤多，某些步骤时间控制严格SilverstainedgelofE.coliLysateIPG4-7SilverstainedwithPlusOne™KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.差异分析蛋白标记挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染考染荧光染色图谱分析2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程凝胶的图像处理分析扫描，图像处理斑点检测和定量数据分析2-DE数据库建立ImageScannerIII图像扫描系统2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程差异分析蛋白标记蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染考染荧光染色挖胶图谱分析Version1A52自动斑点切取——Spotpicker切点针头胶盘2-DE的局限性SWISS一2DPAGE数据库是由日内瓦大学附属医院临床化学中心实验室与瑞士生物信息协会合作创办的人类维凝胶蛋白数据库为在2D凝胶上预测蛋白质迁移提供了许多标化的凝胶图象和工具比较已知细胞类型或组织的凝胶和SWISS一2DPAGE的图象即可以帮助识别关键标志物SWISS-2DPAGEstatisticsMasterCreationLastmodifiedDetectedspotsIdentifiedspotsNo.ofEntriesARABIDOPSISDec-00May-0311117957DICTYSLUGSep-97Sep-9731642516ECOLI3.5-10Aug-95Jan-9823642061804-5Jun-99Dec-0044970334.5-5.5Oct-98Dec-00102597655-6Oct-99Mar-041536106815.5-6.7Dec-00Dec-0060516166-9Dec-00Dec-001100226-11Dec-00Dec-0012373431DIGE4.5-6.5May-03Mar-04858174153MOUSEISLETSSep-98May-0325286344BATDec-00Dec-0022428537WATSep-98Oct-01354013676LIVERSep-98Apr-002836200107NUCLEILIVERApr-00May-034000158MUSCLESep-98May-03265013671STAPHYLOCOCCUSMar-04Mar-04596250198YEASTFeb-95Mar-04194010162HUMANCECJan-98Mar-0430775640CSFAug-93Mar-04166430930DLD1Jan-99Mar-04344010867ELCAug-93Mar-0421443519HEPG2Aug-93Mar-0428629845HEPG2SPAug-93Mar-04173415525HL60Sep-97Mar-0431642617KIDNEYSep-97Mar-0428964428LIVERAug-93Mar-04241313868NUCLEILIVERApr-00Mar-0414972714LYMPHOCYTEMar-04Mar-049267762LYMPHOMAAug-93Mar-0418906033NUCLEOLIHELA2-DPAGENov-01Mar-0412715144NUCLEOLIHELASDS-PAGENov-01Mar-0411598189PLASMAAug-93Mar-04196662670PLATELETAug-93Mar-0421934118RBCAug-93Mar-04180019033U937Aug-93Mar-048954232人类肝脏？？？？？？2生物质谱技术数据及供电系统┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓进样系