食品中微生物数量的检测技术与指示菌类

第六章食品中微生物数量的检测技术与指示菌类一、食品中的菌数检测技术及其新进展二、指示菌类三、其他菌类数量的检测方法第一节食品中的菌数检测方法及其新进展一、显微镜直接计数法二、平皿菌落总数测定法三、最近似数测定法四、还原试验法五、其它方法《中华人民共和国食品卫生法》第四条指出：“食品应当无毒、无害，符合应当有的营养要求，具有相应的色、香、味等感官性状”。这一条就明确地规定了食品的卫生要求。食品的卫生要求检测食品中微生物数量的卫生学意义：可作为食品被微生物污染程度的标志（或食品清洁状态的标志）。预测食品贮存期限（保质期）。食品中细菌总数还能反映食品的新鲜程度、是否发生变质。理想情况：理想的检测方法是对所有食品都适用，并在短时间内获得准确结果。实际上：至今还没有一种通用的方法能准确测出食品中的实际活菌数，都有一定的误差、适用范围和优缺点。一、显微镜直接计数法（DMC）1、直接涂片计数法（1）操作方法将0.01mL经适当稀释的样品均匀涂布于载玻片上的1cm2面积的方格内，经干燥、固定、革兰氏染色后，用显微镜观察计数。在计数前先用物镜测微尺测出油镜视野的直径，再观察计算10~15个视野的细菌总数，求出平均数。）（个菌数mL/g1014.342BrXr——显微镜油镜视野的半径（mm）B——稀释倍数涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定：通过火焰若干次初染：结晶紫一滴，1min，水洗媒染：碘液一滴，1min，水洗脱色：95%乙醇，约30s复染：复红一滴，30s（2）特点操作简便、快捷不能区分活菌与死菌，计数结果偏高，只适用于菌数较高的样品只适用于计数单细胞的微生物2、血球计数板计数法将适当稀释的样品注入血球板的计数室中。由于计数室的容积是已知的（0.1mm3），计算一定微小体积内的菌数，即可计算出每克或每毫升样品中的菌数。菌体细胞数（cfu/ml）=小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数特点操作简便、快速，可在十分钟内得到结果。待测标本未经火焰固定杀死细胞，故所测结果为活菌数。此法适用于计数单细胞的酵母菌。二、平皿菌落总数测定法（SPC）平皿菌落总数测定法是最常用的一种活菌计数法，也是我国卫生标准规定的公认可行的方法，因此又称标准平皿活菌计数法。菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培基基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。只包括一群在平板技术琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。CFU：菌落形成单位国标（GB）规定：在需氧条件下：细菌：PCA36±1℃48h霉菌、酵母：PDA或孟加拉红培养基28±1℃5d酵母菌、霉菌在孟加拉红培养基上典型特征菌落总数的测定－－平板菌落计数法程序菌落计数选择2～3个适当稀释度悬液各1ml，加入无菌空培养皿内，每个稀释度做2～3个培养皿用生理盐水进行无菌稀释，做成几个适当稀释倍数的悬液每个培养皿中倾注约15ml熔化并冷却到46℃左右的平板计数琼脂培养基，冷却后，于37℃培养48h被检样品报告结果（一）样品采集1、采样原则：确定性、随机性、代表性、无菌操作、原始性2、采样方法：无菌操作，分类操作有包装食品应采用完整的未开封的样品粉末状样品边混合边取样液体样品振摇均匀取样冷冻样品保持冷冻状态非冷冻样品保存在0~5℃3、采样数量和部位：（1）即食类预包装食品：取相同批次最小零售原包装（2）非即食类预包装食品：500g或500mL取相同批次最小零售原包装500mL液态食品混匀后，从相同批次的不同容器中取≥5倍检验单位样品500g固体食品从同一包装的不同部位分别取样（3）散装或现场制作食品根据食品不同类别和性质，取≥5倍检验单位样品4、采样标记：及时、准确、清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。5、采样的贮存和运输：应在接近原温条件下尽快送检，并保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原温条件下贮存。样品编号产品名称规格型号注册商标生产厂家通讯地址邮政编码受检地点通讯地址邮政编码采样地点采样日期采样基数生产日期批　　号依据标准检验目地检测项目备　　注有效成分及含量代表单位（章）代表单位（章）签字签字日期年月日日期年月日×××××采样单（二）送检认真核对登记样品信息应按要求尽快检验。如不能及时检验，应采取必要措施保持样品原有状态冷冻食品45℃以下不超过15分钟，或2~5℃不超过18h解冻后检验不得加入防腐剂保存（三）样品的处理和稀释1）取样无菌操作25g（mL）放入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液中（1:10稀释液）2）均匀混合无菌均质杯8000~10000r/min均质1~2min，或用拍击式均质器拍打1~2min3）稀释4）倾注平板稀释液移入平皿后，将46℃左右的平板计数琼脂培养基注入平皿约15ml，转动平皿。5）倒置培养琼脂凝固后，翻转平板细菌：一般食品36±1℃48h水产品30±1℃72h霉菌：28±1℃5d（四）菌落计数法肉眼观察（直接、放大镜）利用自动影像分析菌落计数仪10-1均数10-2均数描述最终结果25536均在30~300间则按计数公式2.6×103多不可计345各平板均300，取稀释度最高者报告，余计为多不可数3.5×104122均小于30则取稀释度最低者报告1.2×10233029所有平板均不在30~300CFU且一部分30或300者以最接近30或300者报告2.9×10300所有平板均无菌落则记为1乘以最低稀释倍数报告1×10即10结果表述（五）菌落计数的报告报告单位：cfu/g(mL)1、平板菌落数的选择：30~300cfu2、菌落数的计算：3、菌落数的报告：低于30时按实数报告100cfu以内时按四舍五入修约，采用两位有效数字报告≥100时第三位数四舍五入修约，取前两位数字例：205043→210000or2.1×105先倒平板，待其凝固后，吸取0.1ml稀释液于平板表面上，用无菌玻璃刮铲在整个平板上均匀涂布，培养观察。涂布平板法涂布法的优缺点可检测到热敏性菌株菌落形态比较明显更适合于严格的好氧菌没有倾注法简便，易造成机械损伤三、最近似数测定法（mostprobablenumberMPN）对未知样品做连续的10倍稀释，选择3个连续的10倍稀释液，每种稀释液接种3管（5管）装有培养基的试管中培养，根据实验结果查MPN检索表，得到样品中微生物的数量。根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表MPN：最可能数，基于泊松分布的一种间接计数方法阳性管数MPN95%可信限0.100.010.001下限上限0003.0-9.50013.00.159.61003.60.17183331100420-MPN的优点：操作简便与SPC相比，相似率较高采用选择性培养基可检测特殊微生物菌群特别适用于检测食品内含菌量较少的样品MPN的缺点：需要大量的玻璃器皿不能观察微生物菌落形态要注意严格的无菌操作食品冷饮大肠菌群检验纸片冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效果检测四、还原试验法一种估计活性微生物数量的方法原理：微生物细胞在进行生物代谢的氧化还原过程中，有的被氧化，有的被还原，测定还原能力即可推测样品内的菌数。某些指示剂和色素可反映这个变化，这些成分的还原时间同细菌数量成反比。三种染料：美蓝：美蓝（蓝色）无色刃天青：刃天青（蓝色）粉红色或无色红四氮唑（TTC）：红四氮唑（无色）粉色或红色美蓝还原试验表美蓝褪色时间估计每毫升样品中的细菌总数鲜乳的质量20min内20000000以上很差20min至2h4000000~20000000差~较差2h至5.5h500000~4000000一般~较好~好5.5h以上500000以下很好美蓝：美蓝（蓝色）无色韧天青还原试验表级别鲜乳的质量乳的颜色相当于每毫升牛乳中的细菌总数经20min经60min1良好青蓝色青蓝色小于50万2合格青蓝色蓝紫色50~400万3不好青蓝色或粉蓝色粉红色400~2000万4很坏白色白色大于2000万刃天青：刃天青（蓝色）粉红色或无色显色状态判断标准显色状态判断显色状态判断未显色者阳性微红色者可疑桃红色-红色阴性红四氮唑（TTC）：红四氮唑（无色）粉色或红色应用及优、缺点：应用：乳品工业上原料乳中的微生物检测优点：简便、快捷、经济缺点：所得结果不够准确不适用于含有还原性酶的食品五、浊度测量法原理利用浊度计或分光光度计测定培养液中微生物的生长量。当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度被减弱。因为菌体不透光，在一定浓度范围内，悬液中单细胞的数量与光密度（OD值）成正比。当细菌浓度达到107个/ml时，培养基会浑浊优点：样品数量较多时，此法与SPC方法相比省时省力。缺点：若样品颜色较深或含有固体颗粒时，不宜采用。菌数测定方法直接法间接法显微镜直接计数法平板菌落总数测定法还原试验法最近似数测定法浊度测量法ATP生物发光法试验测定法电阻抗测量法放射测量法但至今没有一种常用的方法能准确测出食品中的实际活菌数，也没有一种方法对所有的食品都适用。第二节指示菌类一般情况下，若要直接检查食品中的病原菌困难较大实践中，常用某些指示菌类的办法来评定食品的卫生质量表明食品被粪便污染和病原菌存在的指示菌应具备的特征：指示菌必须与肠道致病菌密切相关；指示菌对不良因素的抵抗力与病原菌大致相同；指示菌与病原菌繁殖速度大致相同；培养、分离、鉴定方法简便，容易检验1、大肠菌群（coliforms）卫生细菌领域用语与粪便污染有关的细菌定义：一群在一定培养条件下可发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。典型大肠杆菌为粪便近期污染的标志其它菌属则为粪便陈旧污染的标志ETECEIECEHEC产气克雷白氏菌O157：H72、大肠菌群的食品卫生学意义作为食品被粪便污染的指示菌MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低作为食品被肠道致病菌污染的指示菌大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量3、大肠菌群检测方法与检测结果检测方法：MPN计数法：LST发酵试验BGLB发酵证实试验平板计数法：VRBA平板计数BGLB发酵证实试验见GB/T4789.3-2010检测结果：用每1mL(g)样品中大肠菌群最近似数来表示，简称大肠菌群MPN。LST发酵试验BGLBVRBA平板第三节其他菌类数量的检测方法一、嗜冷菌数量测定采用SPC法，在7℃培养10d观察肉眼可见菌适用于检验鱼类、贝类等冷冻食品和低温冷藏食品中的嗜冷菌二、耐热菌与芽孢数量的测定耐热菌：将少量样品72℃处理15s后，与45℃左右的已溶化的培养基混合，于30~32℃培养48h计数。芽孢数量：将样品分成几份，分别80℃处理10min，85℃处理10~15min后，立即冷却至10℃以下，与45℃左右的已溶化的培养基混合。嗜温菌芽孢30℃培养72h计数，嗜热菌芽孢55℃培养48h计数。三、酵母菌与霉菌数量的测定采用SPC方法，以PDA或孟加拉红培养基于28℃培养5d后观察计数。选取菌落数在10~150CFU之间的平皿计数，其它计数原则、报告方式与菌落总数相似。