张嗣良--发酵工程研究及工艺装备新技术(温州XXXX)

张嗣良华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海）2012.5发酵工程研究及工艺装备新技术发酵工程研究及工艺装备新技术国家生化工程技术研究中心(上海）工作汇报工业发酵技术在国民经济发展中的作用工业发酵技术在国民经济发展中的作用发酵工程发酵工程医药、轻工食品、农业、环保、能源、…医药、轻工食品、农业、环保、能源、…社会可持续发展生物技术发展需求医药、食品领域的重要内容和关键技术新型食品添加剂、防腐剂、功能食品……食品微生物药物新药、抗体疫苗、酶……生物能源纤维素乙醇、生物柴油……环境保护生物治理、生物预报…农业农产品深加工、生物农药与肥料………………¾¾数千年历史数千年历史¾¾技术持续发展技术持续发展¾¾工业生物技术基础工业生物技术基础¾¾社会经济发展必须社会经济发展必须动物细胞大规模培养抗生素、维生素、基因产品生物基化学品可降解塑料、生物乙烯、1、3丙二醇……产品温度pHDO过程菌种高性能菌株对象与目标对象与目标基础理论研究共性关键技术研究产品工艺技术（优化与放大）z生物过程的复杂性：过程优化理论与方法z发酵过程放大技术进展z发酵过程研究的关键共性技术z新型传感技术进展z菌种高通量筛选技术与装置z基于系统生物技术的工业生物制造研究z动物细胞大规模培养技术z从一体化工程设计到一体化运营COMOS数据平台：GMP项目工程设计面临的问题生物过程的复杂性生命科学发展与生物过程复杂系统生命科学发展与生物过程复杂系统存在问题：优化与放大效果差，研究周期长困难：缺乏全局与动态性研究传感器大量生物学信息优化与放大困难优化与放大困难(全局与动态)？仅以传统的生物学方法或化学工程方法有很大局限性细胞内细胞外温度、搅拌、pH、DO、培养基配方…基因、转录、表达、代谢途径……系统动态基质产物过程宏观信息•测量参数及其变化的意义缺乏理解•昀佳工艺控制点为依据的静态操作方法，只是化学工程宏观动力学概念在发酵工程上的简单延伸缺乏以细胞代谢流分析与控制为核心的研究内容™™经典的以动力学为基础的工程学概念经典的以动力学为基础的工程学概念™™经典的以化学计量学和热力学研究为基础的发酵工程生经典的以化学计量学和热力学研究为基础的发酵工程生物学物学过程优化过程优化发酵过程计算机控制z传感器：DO、pH、排气成份分析系统……z计算机控制系统：单片智能、工控机、pLC、DCS……z执行器件：杯式补料系统参数自动控制回路温度自动控制；通气流量自动控制；罐压自动控制pH调节（手控或自控）；DO与转速、通气流量程序串级调节……───效果不明显模型化模型化静态和动态优化系统识别自适应控制专家系统、模糊控制、神经元网络各种混沌现象的研究实际工厂生产───效果不明显过程放大过程放大因次分析法经验法则法数学模拟法时间常数法几何相似流体运动学相似流体动力学相似同时满足这些相似条件是不可能的背景基因工程研究代谢调控研究发酵过程代谢途径研究的困难过程数据采集和处理的困难发酵罐单一生理调控机制的研究，缺乏发酵过程全局优化技术发展中面临的主要问题技术发展中面临的主要问题z仍旧局限于寻求昀佳的温度、pH、DO和培养基配方等z缺乏微观的实时的代谢调控发酵工艺优化研究的基本思路优化与放大技术现状z效率低：10-30%z周期长：月、年z徘徊不前对于活体细胞调控来说，采用传统的生物学方法或化学工程的调控方法，存在很大的问题，国内外都没有很好解决。发酵过程优化与放大仍是一个令人困惑的问题？对于活体细胞调控来说，采用传统的生物学方法或化学工程的调控方法，存在很大的问题，国内外都没有很好解决。背景发酵过程优化放大技术的现状与存在的问题发酵过程优化放大技术的现状与存在的问题„过程优化主要靠人工经验长期摸索───效果差周期长¾提高工业生产规模发酵单位需数年到几十年时间，特别是大宗发酵产品¾新产品或国外引进技术：投产进程慢，周期长„过程放大主要采用人工经验逐级放大──效果差风险大¾从摇瓶到工业规模（1-几百m3）逐级放大，耗时耗财和人力¾放大指数越大风险越大（新设备、新产品）„影响发酵工程整体技术发展和在国民经济发展中的作用¾整体技术：菌种、产品分离、产品质量、节能减排、先进装备技术、…¾大宗发酵产品急需新技术,降低生产成本,提高市场竞争能力¾生物能源等可持续发展的战略需求已经提到议事日程发酵过程优化的基础与应用技术研究发酵过程优化的基础与应用技术研究发酵过程研究的工程学理论基础发酵过程研究的工程学理论基础───为解决过程优化关键技术提供基本方法和理论工程学方法现象与问题：发酵过程是一个高度复杂的生命过程系统，细胞内成千上万个基因、代谢物和反应器的混合传递方法特征；z不同的空间尺度和时间尺度的基因、细胞代谢、反应器混合传递等网络；z网络间存在物质流、能量流、信息流等多输入多输出关系工程学方法：z基于宏观动力学研究的工程学方法的局限性z提出发酵过程复杂系统多尺度参数相关分析理论与方法（2002年）生物反应器——典型的具有时空多尺度结构的复杂系统反应器内的浓度场、温度场、速度场分布颗粒团聚、气泡聚并颗粒聚团内的菌体细胞细胞内代谢网络基因DNA、RNA网络反应器细胞代谢基因水平呈网络多输入多输出关系„不是简单的统计热力学关系„网络结构表现在不同尺度的网络状态的互动关系───多输入多输出关系„能量流、物质流、信息流„生命属性所特有的时空串联反应关系„微生物代谢流───网络研究的的核心问题细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性生物反应器生物反应器细胞生长细胞生长细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性细胞生长细胞生长XmXm(cp)(cp)PPco2PP细胞水平的代谢动力学SURSUROUROURHERHERHH++CERCERPPRPPR传统的生物反应器物料流反馈控制必需高度重视代谢流及其对反应器的影响•产物与代谢流有关•不同层次反应的关联方法(IFB)葡萄糖葡萄糖氮源氮源前体前体油油rpmrpmFFHH++热((MVMVSS))SFRSFROTROTRHTRHTRH+FR反应器混和与传递常规控制器常规控制器生物反应器生物反应器ssDODO剪切TTpHpH(EVs)(PVs)数据驱动型方法复杂性多容量过程高度非线性线性或拟线性关系的数学摸型发酵生产完整过程发酵过程参数趋势曲线相关数学模型、静态和动态优化、系统识别、自适应控制、专家系统、模糊控制、神经元网络、各种混沌现象的研究困难动态性不可预测性跨尺度观察跨尺度观察红霉素头孢菌素C维生素B12阿维菌素重组植酸酶……红霉素头孢菌素C维生素B12阿维菌素重组植酸酶……新工艺新装置新工艺新装置应用与推广流场特性研究（CFD、PIV）创新点3过程放大代谢机制(微观)(组学、酶、代谢谱、13C）创新点2过程优化生理特性(宏观)(OUR、CER、RQ)传感器、软件包、反应器设计创新点1过程信息与装置技术内容与创新点研究对象总体总体思路思路提出发酵过程复杂系统多尺度参数相关分析理论与方法（2002年）──发酵过程研究的工程学理论基础──发酵过程研究的工程学理论基础参数检测配置示意图在2000年上海国际工业博览会上展出的FUS-50L(A)发酵罐软件设计数据处理功能BlORADAR。•在线检测参数•实验室手工测定参数•间接参数(代谢流特征或工程特征)•适应多种反应器特点•融合多种过程理论和控制理论•工艺分析与操作•远程通讯与异地数据传送和分析DO-发酵液中溶解氧浓度、OUR-菌体代谢耗氧速率、CER-二氧化碳释放速率、RQ-呼吸商-代谢途径、KLa-生物反应器中氧传递速率、pH酸碱度、菌体浓度、…等40多个参数9-25小时之间RQ呈低谷状必需限制补葡萄糖0-8小时:OUR、CER、DO、pH、RQ、F──不同水平8.9小时:OUR与CER继续上升呈分枝态pH迅速上升RQ呈低谷状──非葡萄糖碳源利用25小时前:必需限制补加葡萄糖速率(RGLU)混沌现象9小时左右CER、OUR、pH和DO都有一个对应的上升或下降峰。这种峰值的高低以及出现的时间反映了发酵初期的系统特征━━出现混沌现象次级代谢产物伴随着菌丝分化和次级代谢产物的形成初级代谢转向次级代谢的时间、控制因素不确定──混沌5000u/ml基因水平(Science,2001,293(5530):614)严紧响应(stringentresponse)营养缺乏起动──终止RNA在胞内积累，(p)ppGpp的启动表达合成(p)ppGpp合成酶Ⅰ（严紧响应因子）ppGpppppGpp抗生素菌丝分化DNAmRNA核糖体空载tRNA(氨基酸缺乏)5’黄豆饼粉的调控机制•9至25小时，除作氮源外同时作为主要碳源使用•形成氨基酸等营养缺乏时的严紧响应，在翻译水平上进行调控，启动次级代谢•黄豆饼粉利用时间、与其它碳源的竞争性利用特点、补料策略、pH控制、DO控制等应从三个水平上进行综合考虑5000u/ml───8200u/ml红霉素发酵单位历年增长情况010002000300040005000600070008000900010000195519621968197419801986199219982001国际水平u/ml生物反应器装备技术进展生物反应器装备技术进展：首次自主集成开发了用于生物反应器细胞生理代谢特性检测与分析的装备体系，为建立发酵过程宏观现象（发酵表型）与菌体生理特性的微观机制间的关联研究提供软硬件基础海量数据中寻找过程优化敏感参数───发酵过程优化与放大的关键点海量数据中寻找过程优化敏感参数海量数据中寻找过程优化敏感参数───发酵过程优化与放大的关键点───发酵过程优化与放大的关键点质谱仪多参数发酵罐解决发酵过程特殊传感器应用和测定技术的困难，实现各种操作参数和生理参数的实时动态检测──────传感器技术传感器技术专业软件包与模型的建立：发酵过程海量数据处理，集工艺研究与数据动态相关分析为一体───数据处理与计算机技术数据处理与计算机技术不同尺度参数相关：每个尺度（基因、细胞、反应器）网络通过网络间的输入输出，形成对复杂系统的影响───生物学研究生物学研究生物过程先进传感技术生物过程先进传感技术(1)尾气在线质谱技术(3)在线显微观察仪(2)活细胞量在线测定技术(4)原位红外光谱检测技术(5)同位素13C的细胞微观代谢检测技术过程信息处理系统过程信息处理系统基于工业以太网技术，多种分析仪器与执行装置的信息无缝对接，不同中间分析实验室或异地工厂的发酵过程数据可同步实时共享发酵过程优化技术进展：基于微观与宏观相结合的发酵过程代谢流分析，实现菌体细胞微观代谢特性的宏观观测与控制──发酵过程优化的关键问题1.按照多尺度关联与调控的要求，采集发酵过程宏观与微观参数，形成状态变量估计，由此研究宏观细胞生理状态、反应器流场状态特征与微观机制（包括生化代谢网络）的关联。状态变量：生理状态反应器流场状态操作条件基质、产物状态变量：生理状态反应器流场状态操作条件基质、产物重要的食品添加剂发酵生产取得突破──呈味核苷酸二钠（鸟苷）发酵过程优化未知代谢物发现未知代谢物发现z小试与中试规模：17.2g/L→34g/L(60小时)z100m3生产规模效价提高1倍：16g/L→32g/L(60小时)打破了日、韩对我国的生产和市场挤压，使濒临停产的投资2.1亿的工厂恢复生产，并在国内外市场竞争中取胜。鸟苷细胞代谢途径细胞代谢途径代谢流迁移跨尺度测量多尺度相关分析与数学模型验证酶学与代谢流酶学与代谢流分析检验分析检验发酵罐数据采集发酵罐数据采集解除ATP、柠檬酸的抑制AMPPi激活作用NH4+丙酮酸代谢固定CO2顺乌头酸酶失活：Fe2+异柠檬酸失活:Cu2+0.3mg/L、Fe2+2mg/L和pH2.0情况下α-酮戊二酸脱氢酶的调节:高葡萄糖和NH4+阻遏柠檬酸积累的代谢调节产品1.3-二磷酸甘油酸ADPATP3磷酸甘油酸葡萄糖甘油醛-3-磷酸NADHNAD+PEP丙酮酸ADPATP乙酰CoANAD+NADH1/2O2+H+NADH呼吸链NAD+2e-H2O3ATP3ADP能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活，使葡萄糖到柠檬酸的代谢受影响。。能荷的