(整理)-分子生物学复习资料.

精品文档精品文档2013-2014分子生物学复习资料一、中心法则DNARNA蛋白质二、DNA复制(一)DNA复制的特点1、半保留复制DNA复制时分别以两条亲代链作为模板链通过酶催化各形成一条子代链，亲代链分开处即子代链合成处成为复制叉。2、半不连续复制DNA亲代链5’到3’方向的复制时，是以小片段的形式从5’到3’不连续的复制形成冈崎片段，再经DNA连接酶连接形成一条链。3、RNA的引导RNA的引导保证DNA复制的高忠实性。（二）DNA复制所需要的酶1、原核中：（１）DNA解旋酶：利用ATP水解的能量解开双链ＤＮＡ（２）DNA旋转酶（Ⅱ型拓扑异构酶）：引入负超螺旋从而释放正超螺旋。（3）DNA聚合酶Ⅲ：延伸前导链和后随链中的引物。（4）DNA聚合酶Ⅰ：切除引物。（5）DNA连接酶：连接冈崎片段形成ＤＮＡ子代链。2、真核中：（１）DNA聚合酶α：前导链和后随链的每个片段都是利用其引发酶活性从RNA引物开始。（２）DNA聚合酶δ：在前导链上替代前一种酶继续延伸。（３）DNA聚合酶ε：在后随链上完成DNA的复制。（三）DNA聚合酶1、真核中：真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发具5－3外切酶活性），β（定位于核内，参与修复，具5－3外切精品文档精品文档酶活性），γ（定位于线粒体，参与线粒体复制具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，参与复制，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位于核，参与损伤修复，具有3－5和5－3外切活性）。2、原核中：原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。功能polⅠpolⅡpolⅢ聚合作用5'→3'＋＋＋外切酶活性3'→5'＋＋＋内切酶活性5'→3'＋－＋焦磷酸解和焦磷酸交换作用＋－＋完整的DNA双链－－－带引物的长单链DNA＋－－带缺口的双链DNA＋－－双链而有间障的DNA＋＋＋分子量（ｋｄ）109120140（四）DNA的损伤与修复1、诱变（1）突变1)点突变：一个单一碱基的改变转换：嘌呤与嘌呤之间或是嘧啶与嘧啶之间颠换：嘌呤与嘧啶之间或是嘧啶与嘌呤之间2)沉默突变：突变发生在ＤＮＡ的非编码区、非调节区或密码子的第三个碱基位置，不影响掺进蛋白质中的氨基酸3)错义突变：突变改变了基因产物的一个氨基酸4)移码突变：插入或缺失涉及一个或多个碱基的增加或丢失（２）物理诱变：高能离子化辐射，如Ｘ射线、γ射线、紫外线（嘧啶二聚体是常见的一种产物）精品文档精品文档（３）化学诱变：碱基类似物（直接诱变）、亚硝酸、烷化剂等２、损伤（１）氧化性损伤（２）烷基化（如ＭＭＳ、ＥＮＵ）（３）聚化加合物３、修复（１）光复活：在可见光下，ＤＮＡ光解酶可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体（２）烷基转移酶（３）切除修复：核苷酸切除修复和碱基切除修复（４）错配修复（５）遗传性修复（五）ＤＮＡ的克隆１、ＤＮＡ的制备（１）质粒DNA的制备碱裂解法：从染色体ＤＮＡ及大部分其他细胞成分中纯化酚抽提法：采用酚或酚－氯仿混合物进行抽提乙醇沉淀：氯化铯梯度法：（２）噬菌体DNA的制备2、载体（1）质粒载体1)插入失活原理：pBR322及其衍生物包含两个抗生素抗性基因，ampr和tetr，当目的基因插入其中一个时，会导致该基因失活。2)蓝白斑筛选：在质粒中含有LacZ基因（编码β-半乳糖苷酶，受Lac启动子的调控）的α-肽的序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达α-肽，它与宿主菌的LacZM15基因的产物互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；外源基因插入后，肽基因阅读框架被破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色（阳性克隆）。精品文档精品文档（2）噬菌体载体噬菌体颗粒将其线性DNA注入细胞，进而DNA连成环状，其后该DNA被复制组装成噬菌体颗粒，经裂解细胞释放到胞外，造成细胞死亡，或通过特异位点将其DNA整合到宿主基因组，而获得长期插入。（3）其他载体黏粒载体：利用λ噬菌体cos位点YAC：酵母人工染色体BAC：细菌人工染色体（六）基因文库1、基因组文库（DNA来自基因组DNA）文库的大小)1(1)p1(lnNfn，p代表给定概率，f是插入片段大小占总基因大小的比例。2、cDNA文库（DNA来自群体mRNA的拷贝）cDNA第二条链的合成：a)自身引物合成法：cDNA/mRNA杂合体用碱处理后获得单链cDNA，随即在3’端形成一个短小的发夹结构，次发夹结构可以作为引物合成第二条链。最后用SI核酸酶处理除去末端发夹结构，但5’端部分序列会因此而失去。b)置换合成法：RNaseH在mRNA上产生缺口（内切作用）残存的ＲＮＡ可以作为合成第二条链的引物，最后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接修复缺口。通过这种方法可以获得近乎全长的dscDNA。c)引导合成法：NaoH降解杂交链中的mRNA，然后用末端转移酶在cDNA３＇端加聚Ｃ尾巴，以Oligo（dG）为引物合成第二条链，这种方法可获得全长的dscDNA。(七)DNA测序1、双脱氧链终止法测序的原理DNA聚合酶能利用单链ＤＮＡ为模板，离体合成其互补链，当反应液中２＇，３＇－双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ），它可以像２＇－脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰ）那样直接掺入新合成的ＤＮＡ链中，但因ｄｄＮＴＰ３＇端不具－ＯＨ，所精品文档精品文档以寡核苷酸链不再继续延长，即ＤＮＡ链合成终止。在４个反应管中同时加入同一种合成ＤＮＡ的被标记的引物和待测序的ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶１、４种脱氧核苷三磷酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ），并在这４个管中分别加入４种不同的２＇，３＇－双脱氧核苷三磷酸。反应将产生不同长度的DNA片段混合物，他们都带有ddNTP的3’末端。将这些混合物进行变性凝胶电泳分离，就可以获得一系列不同长度的DNA普带。再通过放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。最后可以在放射性Ｘ光底片上，直接读出ＤＮＡ序列。2、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ化学降解法：首先放射性标记待测序ＤＮＡ的一端，并将其分为４份，分别用不同的化，学试剂进行４种裂解反应，每种反应之断裂某一种或某一类碱基，结果可产生４种起始于放射性标记末端的不同长度的标记分子，经变性ＰＡＧＥ凝胶电泳分离各组不同大小长的ＤＮＡ片段，并进行放射自显影，可根据Ｘ光片上所显现的相应普带，读出ＤＮＡ的核苷酸序列。3、ＤＮＡ的自动测序：基于双脱氧链终止法测序原理，也是通过４个酶学反应利用ｄｄＮＴＰｓ产生一系列一端固定、另一端终止于不同Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ碱基位点的DNA片段。三、RNA转录乳糖操纵子1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP（ｃＡＭＰ受体蛋白）的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP精品文档精品文档浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。四、蛋白质翻译顺式调控元件与反式作用因子关系：顺式作用元件：真核生物中没有操纵子，调节基因中调控序列有许多能结合动中调控蛋白的元件叫顺式作用元件，它们往往与结构基因保持一定的距离。反式作用因子：指和顺式作用元件结合的可扩散性蛋白，包括基础因子，上游因子，诱导因子。摆动假说解释遗传密码简并性的假说，克里克（F.H.C.Crick）于1966年提出。对氨基酸专一的密码子的头两个碱基与相应转移RNA上反密码子的第2个和第3个碱基互补配对，而密码子的第3个碱基（3'端）与反密码子5'端碱基的配对专一性相对较差，被称为摆动配对（wobblepairing）。在反密码子的5'位置上常发现次黄嘌呤（Ⅰ）或与之相似，仅能形成2个氢键的嘧啶。GU-AG法则多数细胞核mRNA前体中内含子的5‘边界序列为GU，3’边界序列为AG。因此，GU表示供体衔接点的5‘端，AG表示接纳体衔接点的3’端。把这种保守序列模式称为GU-AG法则，又称为Chambon法则。ORF开放阅读框[openreadingframe，ORF]是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。B型DNA（1）DNA双螺旋精品文档精品文档两条反向平行的互补双螺旋链，一条方向为5‘→3’，另一条方向为3‘→5’，围绕同一中心纵轴，从右向上盘旋。双螺旋磷酸-脱氧核糖主链在外，位于内的碱基平面与中心轴垂直。每个碱基相聚0.34nm，同条链相邻碱基夹角36度，每10个碱基形成螺旋1周，螺距3.4nm。露于螺旋外的磷原子离中心轴1.0nm，易与阳离子接近。两条链相互碱基互补配对，即AT/GC，分别以2个和3个氢键相连。两条单链之间由小沟，两个双链之间有大沟，他们在DNA双螺旋外交替出现。（2）B型DNA被认为是最稳定的结构，有特殊的螺旋重复（每砸１０ｂｐ），几乎与螺旋轴垂直，有一条主沟和一条小沟。（3）其他类型的ＤＮＡＡ型ＤＮＡ和Ｂ型一样为右旋，但较宽，结构更加紧密，碱基对倾斜于螺旋轴线，且偏离细线，重复每砸为１１ｂｐ。Ｚ型是左旋，有一个Ｚ字形的外观，每砸１２ｂｐ碱基对。poly(A)tail的作用有助于稳定整个分子；和poly(A)结合起抵抗３＇－外切核苷酸酶攻击的作用；有助于细胞质中成熟ｍＲＮＡ的翻译氨酰tRNA合成酶a)氨酰-TRNA合成酶使氨基酸结合到特定的ｔRNA上：每一个氨酰-TRNA合成酶可识别一个特定的氨基酸和与此氨基酸对应的TRNA的特定部位。b)氨酰-TRNA合成酶的辨认位点：大肠杆菌TRNAALA氨基酸臂是酶的辨认位点。Tm值DNA的解链温度（Tm）是引物的一个重要参数，它是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，一种DNA分子的Tm值大小与其所含碱基中的精品文档精品文档G＋C比例相关，G＋C比例越高，Tm值越高。Tm=4（G+C）+2（A+T）tRNA的结构a)tRNA的一级结构：四种常见的修饰碱基，分别是胸腺嘧啶核糖核苷（T）、假尿嘧啶核苷（ψ）、二氢尿苷（D）、肌苷（I）。b)tRNA的二级结构：来自不同生物的tRNA，尽管一级序列不同，但都具有三叶草样的二级结构。氨基酸臂：是tRNA分子的5ˊ端和3ˊ端附近的碱基配对形成的臂。一个成熟的tRNA分子的3ˊ端的核苷酸序列总是CCA（3ˊ），一个特异的氨基酸通过它的羧基与tRNA的3ˊ端的腺苷酸残基的2ˊ或3ˊ羟基形成的共价键连接在tRNA分子上。另外所有tRNA分子5ˊ端的核苷酸都是磷酸化的，而且大多数tRNA分子5ˊ端的核苷酸残基为鸟苷酸残基（pG）。反密码环：位于氨基酸臂对面的单链环（anticodonloop），该环含有由三个核苷酸残精品文档精品文档基组成的反密码子（anticodon），反密码子与mRNA中的互补密码结合。反密码臂（anticodonarm）：含有反密码子的臂。TψC臂：含有胸腺嘧啶核苷酸（T）（在RNA中很少见到）、假尿嘧啶核苷酸（ψ）和胞嘧啶核苷酸（C）残基的臂。D臂（Darm）：含有二氢尿嘧啶核苷酸残基的臂，不同tRNA的