3分子生态学

第三章分子生态学王根轩电话：86971083，13336061808E-Mail:[e-mail]内容•1分子生态学的产生与发展•2分子生态学的理论基础•3分子生态学的研究方法•4前沿进展举例2-1:分子生态学的产生与发展一、分子生态学与生命科学•生态系统的三个层次：以个体为基础的宏观生态系统以细胞为基础的微生态学统以核酸分子和其他生物活性分子为基础的分子生态系统分子生态学（Burk,1994)：~是分子生物学与生态学融合而成的新的生物学分枝学科。而不仅只是应用分子生物学技术研究生态学问题。向近敏等（2000）：~应当是研究生物活性分子在其显示与生命关联的活动中所牵连到的分子环境问题。其定义有两层含义：1、运用现代分子生物学技术研究传统生态学问题；2、生物活性分子表现其生命活动时的分子生态条件的规律性。10-910-610-31103106109Scale(m)生理学细胞学分子生物学生态学分子生态学尺度与学科的关系示意图分子生态学的多学科交叉特性分子生物学多学科交叉的复合学科：群体遗传学行为生物学进化生物学古地学/古气候学保护生物学分子进化系统发生学数学生物地理学生态学古生物学分子生态学ModelofDNAbuiltbyWatsonandFrancisCrickatCambridgeUniversity,1953.分子生物学与生态学紧密联系：基因研究首先从生物的生态特征和适应入手。Anoverviewdepictingseveralofthemostimportantearlydiscoveriesonthenatureofthegene.二、分子生态学的起源•1950s:凝胶电泳技术（Smithies,1955)和蛋白质组织化学染色方法（Hunter&Marker1957)的发明和有机结合，促进了利用蛋白质多态性方法分析遗传变异。•1960s:分子进化的中性理论的提出(Kimura1968)和限制性内切酶的发现（Linn&Arber1968)为限制性内切酶长度多态性（RFLP）分析提供了工具。•1970s:DNA转膜杂交（Southern1975);线粒体DNA遗传变异性的发现（Brown&Vinograd1974);DNA测序（Sangeretal.1977);DNA克隆技术（Maniatisetal.1978)•1980s:PCR;热稳定DNA聚合酶（Saikietal.1985,1988).•1992:TheJournalof“MolecularEcology”.2-2:分子生态学的理论基础•一分子进化的中性理论（neutraltheoryofmolecularevolution):•1、理论核心：分子水平上的绝大多数突变是选择上中性的，因而他们在进化中的命运是随机漂变的，而不是由自然选择决定的。•2、中性理论对种内遗传变异的解释：分子水平上的绝大部分种内遗传变异（即遗传多态现象）是选择上中型的，突变速率和遗传漂变速率决定遗传多态性的变化速率。•中性突变与自然选择的辨证统一：少量突变的非中性。•中性理论在分子生态中的应用：排除假设的基础。种群遗传进化：选择、突变、随机遗传漂变、迁移、自然灾害、社会结构等。二、Hardy-Weinbergprinciple•内涵：在满足下列假设的条件下，生物种群的等位基因频率和基因型频率保持不变（1）有性繁殖并随机交配；（2）等位基因在雌雄两性中随机交配；（3）种群足够大；（4）世代不重叠；（5）没有自然选择、突变和迁移。•分子生态意义：作为基本判别假设和理论基础。三种群分化是生物进化的必要途径•1、种群分化的结果：•新种形成•种群的杂合度降低•2、Wright’sF统计方法，•F近似地代表等位基因被固定的可能性，又称固定系数。•亚种群相对于整个种群的近交系数：FST=(HT-HS)/HT•个体相对于所属亚种群的近交系数：FIS=(HS-HI)/HS•个体相对于整个种群的近交系数：FIT=(HT-HI)/HT•HI,HS,HT分别表示个体、亚种群和种群的平均杂合度；(1-FIS)(1-FST)=(1-FIT)四随机遗传漂变是种群进化的重要动力•小种群比大种群发生漂变的速度快，所以等位基因在小种群中被固定的平均时间比大种群短。•一个等位基因被固定的概率等于其此时在种群中的频率，所以稀有基因更易被淘汰。•随机遗传漂变降低种群的遗传多样性。•因为新突变被固定的概率等于其此时在种群中的频率，所以，新突变在小种群中被固定的可能性大于在大种群中。•在metapopulation中，局部种群越小其遗传多样性丧失的越快，局部种群间的遗传分化就越大。•对所有中性等位基因的作用一致，因此，在没有其它进化动力的条件下，不同的中性位点揭示的进化（演化）规律应相同。五朔祖理论（Coalecenttheory)•Hudson(1990):朔祖过程演化分支过程假定种群在个世代保持数目恒定，即每个等位基因有N个拷贝，则种群中任一对基因a在t时代以前的概率为：p=(1-1/N)t-1/N单倍体朔祖时间N，二倍体为2N六分子系统发生分析•分子系统发生（异中求同）分析的基本原则：（1）分子标记的中性原则；（2）进化速率恒定原则，符合“分子钟”假设；（3）分子标记在研究类群中直向同源（4）分子标记具有适当的遗传变异度六分子系统发生分析•1距离法依据每对单元间的进化距离建立进化树；•2简约法最大简约法：对于分子数据，该方法计算在最少的碱基替换条件下能够解释整个进化过程的拓扑结构（系统进化树）。•3最大似然法：对观察数据符合每种拓扑结构的可能性进行最大化计算，可能性最大的拓扑结构被选为终解进化树。•4贝斯法：检验观测数据与理论假设的偏离是否大到否定假设的程度，或者现有数据是否足以支持作出有关结论（Shoemakeretal.1998).2-3分子生态学的研究方法•1、突变体的筛选与使用。•2、分子标记（蛋白质，DNA）线粒体DNA标记叶绿体DNA标记细胞核DNA标记（单拷贝DNA，核糖体DNA,微卫星和小卫星，AFLP,RAPD）•3、遗传变异检测序列分析片段分析一、突变体的筛选与使用•突变体的筛选与使用在重要生态功能的分子基础（分子生态学）研究中发挥着重要作用，并被欧美一流的学者首选。诱导突变一定生态条件下筛选基因定位和测序得到基因突变与生态功能的关系已有的突变材料生态功能对比研究得到基因突变与生态功能的关系二、分子标记•蛋白质标记系统：•同工酶分析•DNA标记系统1、线粒体DNA标记•优点：（1）母性遗传，无重组；•（2）容易设计保守性通用引物；•（3）有效单倍性，即细胞中各线粒体的DNA拷贝的遗传组成等同。•（4）哺乳动物线粒体DNA的进化速率约为核DNA的10倍（植物的进化速率很低且基因重组频繁）；•缺点：不少物种的核基因组存在与线粒体DNA同源的线粒体假基因，干扰线粒体DNA标记的使用。2、叶绿体DNA标记•优点：（1）大部分为母性遗传；•（2）进化速率小，适合种以上水平的系统发生研究•缺点：不太适合种内遗传变异的研究；•由于存在一些父性遗传和双亲遗传的情况，其有效单倍性需要具体分析。•3、单拷贝核DNA标记•单拷贝核DNA：核基因组中拷贝数为1的DNA序列（scnDNA)；•优点：对运用朔祖理论进行进化谱系分析非常重要且十分有效；•缺点：•（1）目前通用的scnDNA标记较少，不得不为每一研究对象建立一套scnDNA标记；•（2）二倍体或多倍体杂合性的存在，使单倍型分析很困难；•（3）基因重组的广泛存在，使数据分析难度增加。4、核糖体(r)DNA标记•rDNA标记的优点：•（1）重复序列拷贝数服从协同进化规律，因而表现出有效单倍性；•（2）由编码区和非编码区嵌合存在，可以根据保守性强的编码区设计通用引物；•缺点：（1）变异速率低，种内变异研究的价值因种而异；•（2）需要检验符合协同进化规律的程度，因为有例外。*协同进化Concertedevolution:Theprocessbywhichaseriesofnucleotidesequencesordifferentmembersofagenefamilyremainsimilaroridenticalthroughtime.Coevolution:Evolutionarychangesinoneormorespeciesinresponsetochangesinothrespeciesinthesamecommunity.5、微卫星和小卫星DNA标记•微卫星DNA：重复单位1~6个核苷酸；如：（GT)n优点：主要表现为拷贝数n的变化，便于分析，应用日广。•小卫星DNA：重复单位6个核苷酸,通常10~30核苷酸；标记长度大，基因型自动分析不方便，使用频率在下降。5、微卫星和小卫星DNA标记•1、多位点微卫星指纹分析法：总核DNA内切酶解酶解DNA片段微卫星DNA探针杂交遗传变异检测缺点：1、对DNA的质量和数量要求较高；2、难以对数据进行深度进化遗传学分析。5、微卫星和小卫星DNA标记•2、基于PCR的多位点微卫星分析法核DNA样品合成微卫星序列引物PCR电泳，对比条带差异优点：简单易行；缺点：隐含不确定性，不宜用于种群遗传进化研究：（1）PCR重复不稳定性；（2）带型有效性（3）条带同源性。5、微卫星和小卫星DNA标记•3、位点特异性微卫星分析法：•微卫星重复序列区非重复特异序列区根据特异序列设计引物PCRDNA电泳6、AFLP标记•AFLP：Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,扩增片段长度多态性。ZabeauMarc&VosPieter(1993)创立。内切酶解酶解DNA片段总核DNA双链人工接头连接特异标记引物PCR限制性片段差异优：需DNA量少；多态性丰富；重复性好；缺：对样品DNA质量要求高；多态片段中有共显性表达现象。7、RAPD标记•RAPD：RandomamplifiedpolymorphicDNA,随机扩增DNA多态性~10bp寡核苷酸随机单引物核DNAPCR电泳分离优：1技术通用，一套引物可用于不同物种；2简单高效快速；3需样量少；缺：重复性差，对实验条件极敏感；有假阳性和假阴性结果；显性标记，不能提供完整的遗传信息。1995年新出现的基因表达序列分析法(SAGE)：特点：利用特定内切酶，从每个mRNA中切下9-13bp的标签能够几乎同时分析整个基因组的各个基因的表达频度最先用于研究癌细胞基因组的表达模式(Velculescuetal.1995,Science)，但此方法为研究多基因控制性状的分子基础提供了方便三、遗传变异检测1、序列分析（Sequenceanalysis)；（1）含系统全面的遗传信息；（2）确切的共祖信息；（3）序列差异标准较统一。（4）缺点：成本较高。三、遗传变异检测2、片段分析（Fragmentanalysis):(1）长度分析：如GeneScan.(2)SSCP分析：单链构象多态性（Single-standconformationpolymorphism)分析.在非变性条件下，单链DNA分子可以形成不同的构象，不同构象的DNA分子有不同的电泳迁移率。可以用电泳检测。最适范围：200~400bp.(3)DGGE(Denaturinggradientgelelectropgoresis)通常使用化学变性剂（尿素、甲酰胺等）梯度(4)TGGE(Temperaruregradientgelelectrophoresis)（5）DHPLC(denaturinghighperformanceliquidchromatography).利用异源双链与同源双链对介质有不同亲和力的原理。2-4前沿进展举例：研究举例1：单配偶制和婚外交配行为(extra－paircopulation，EPCs)•单配偶制是雌雄两性个体彼此占有，这种独占或是直接的，或是通过控制资源而实现的。鸟类以一雌一雄制较普遍，只有少数是例外（MockandFujika1990）。•目前应用分子标记的方法