红细胞膜流动性测定方法

悬浮后，红细胞膜蛋白定量，用考马斯亮蓝法三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250（红褐色）100mg溶于50ml95%乙醇中，加100ml85%磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1ml,5ml）3、可见光分光光度计四、操作步骤（一）标准曲线的制作1、取7支试管，按下表加入试剂试管编号试剂(ml)01234561mg/ml牛血清蛋白00.10.20.40.60.81蒸馏水10.90.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂55555552、将试管摇匀，放置20分钟。3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。（二）样品的测定1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.2、将试管摇匀，放置20分钟。3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。调整蛋白浓度为200~800ug/ml荧光偏振法DPH溶液：将0.464mgDPH溶于1ml四氢呋喃中配制储备液，浓度为2×10^-3mol/l，剧烈振摇3~5min,f放在棕色瓶中，避光保存于-20℃冰箱。临用前从冰箱取出，在室温下融化，每次试验前再用PBS(0.01mmol/l，ph=7.4)）稀释成2×10^-6mol/l的工作液。稀释时必须猛烈摇晃2~3min,红细胞膜的荧光标记：将洗净的红细胞与2×10^-6mol/lDPH在25℃条件下温育30分钟。加入肝素抗凝的新鲜血液3000r/min离心5min,加PBS缓冲液,洗涤三次，去除上清在红细胞沉淀中加入8ml的10mmol/lph=7.4的HCL溶液，同时加入适量的蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟，4℃溶血过夜，使红细胞膜破膜，使红细胞溶液以1200r/min，4℃离心30min,弃上清液，10mmol/lPH=7.4Tris-HCL溶液同样转数离心洗涤三次，辞去白色沉淀物，最后1:1悬浮在等体积的ph=7.4的PBS溶液中。用考马斯亮蓝法得到红细胞膜影泡，(dph做荧光探针)取新配制的2mmol/l的DPH四氢呋喃液1ml,分别加入200ul红细胞膜影泡悬液及2mlPBS缓冲液，快速混匀配置，在37℃下水浴30min，3000r/min，离心10min,弃去残留DPH标记液，用等渗PBS（磷酸盐缓冲液）洗两遍，再用等渗PBS缓冲液稀释成4ml细胞悬液。在石英杯中用荧光分光光度仪检测荧光偏振度荧光偏振法测定：测定参数：激发波长（EX）362nm，发射波长（EM）432nm,激发狭缝为5nm发射狭缝10nm,根据下列(Ex)362nm，发射波长(EM)432nm，根据下列公式分别计算偏振度(P)、微黏度(11)和膜脂流动性值偏振度P=(I。一GIh)／(I。+GIh)(G为校正因子，G=I1-I2I1为起偏器光轴是水平方向，检测器光轴为垂直方向的荧光强度，I2为起偏器和检偏器光轴均为水平方向时的荧光强度)式中I。为起偏器和检偏器光轴均在垂直方向的光强度，Ih为起偏器光轴在垂直方向、检偏器光轴在水平方向的光强度。膜脂流动性LFU=(P最大／1)r一1)／Pr式中P最大为0．5，Pr为P的实测值。微黏度n=2P／(0．46一Pr)(0．46为常数)做三组，红细胞膜用DPH液标记，红细胞膜未用DPH液标记，DPH液(二)操作步骤1.开机：接通电源，打开主机开关，点燃(打开)光源后，根据说明书要求启动计算机。2.检测前准备：参照仪器说明书，在20天内至少进行一次激发校准和发射校准，检测前仪器应预热。3.工作条件的选择：环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定，无磁场、电场干扰。根据样品的特性及荧光强度，选择合适的仪器工作条件(如狭缝、PM增益、响应时间等)。4.基本测定(1)荧光激发光谱测定设置仪器参数，扫描发射波长，找到maxλem，以此为发射波长，记录发射强度作为激发波长的函数，便得到激发光谱。(2)荧光发射光谱测定设置仪器参数，扫描激发波长，找到maxλex，以此为激发波长，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。(3)差谱测定设置仪器参数，选择合适的工作方式，测定背景溶液的发射光谱并储存起来，在一定的工作方式下，扫描样品溶液的发射波长，得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值，即差谱。(4)峰面积积分选择适当的工作方式，对样品溶液进行积分操作，即得到峰面积积分。(5)荧光强度选择合适的测量参数，设置λex、λem，采用定点读数或扫描方式，即可测得所选波长处的荧光强度。(6)定量测定配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置λex、λem，按照由稀至浓的次序，测定标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度—浓度的工作曲线，不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。(三)分析结果的表述1.荧光激发光谱、发射光谱以及其他光谱由仪器控制电脑直接绘出。2.峰面积积分、荧光强度由仪器控制电脑计算显示。3.定量测试：在相同的测定条件下，测定一系列已知浓度的标准溶液的荧光强度，绘制出荧光强度-浓度的工作曲线。浓度未知的溶液的荧光强度测定后，由工作曲线求出该溶液的浓度。(四)注意事项1.在实验开始前，应提前打开仪器预热，并配制好所需的溶液，对于已经配制好的溶液，在不用时放在4℃冰箱中保存，放置时间超过一星期的溶液要重新配制。2.实验所用的样品池是四面透光的石英池，拿取的时候用手指掐住池体的上角部，不能接触到四个面，清洗样品池后应用擦镜纸对其四个面进行轻轻擦拭。3.在测试样品时，注意荧光强度范围的设定不要太高，以免测得的荧光强度超过仪器的测定上限。4.实验结束后，要及时的清理台面，处理废液，清洗和放置好样品池，将下次要用的溶液放回冰箱，并且按规定登记实验记录，养成良好的实验习惯。先打开程序进入荧光的界面，点击configure（最上面一排）下的paramaters设置你的激发波长和发射波长，以及荧光强度的最大和最小值，好了之后点击OK，再在最下面一排中找到0.00（Aurozero）点击之，最后点击算他strat，开始扫描。完成之后需要查看数据就打开manipulate（最上面）下的peakpick看吸收峰位和峰强，或者poinkpick，输入你要看的波长，点击OK就可以看到任意你需要的波长处的峰强了。