树脂包埋样品的免疫金标

树脂包埋样品的免疫金标记技术胡东维洪健一、免疫胶体金标记的原理免疫标记的基本原理是抗体对抗原分子的特异性识别与结合(binding)。广义的免疫标记则泛指各种利用生物大分子间相互识别与结合的原理进行的细胞组分标记。例如：ProteinA、ProteinG对IgG的识别、亲和素对生物素的识别、毒素对底物的识别；纤维素酶、几丁质酶、漆酶可分别特异性地识别纤维素、几丁质、多酚化合物。根据标记步骤的不同，免疫标记份直接和间接的标记。免疫金探针就是在一定条件下，将5~20nm的金颗粒表面结合上抗体分子或各种探针蛋白。二、样品的包埋处理低温包埋：样品前处理在低温下脱水、并在长紫外光照射下低温聚合。可防止常温或高温下部分细胞组分特别是蛋白的变性或降解，以及长时间醛类固定对蛋白活性结构的影响。缺点是固定时间短，细胞结构保存不理想。常温包埋：即一般超微结构的常规包埋处理。可很好的保存细胞结构。适宜于对醛类固定不敏感或对高温处理具有耐性的生物分子的标记。例如，纤维素、外泌蛋白、储藏累蛋白、蛋白多糖等。低温包埋剂Lowicryl树脂：低粘度，易操作。包括K4M、K11M、HM20、HM23四种剂型。前两种具有亲水特性，分别在-35℃和-60℃下聚合。后两种具有疏水特性，分别在-40℃和-80℃下聚合。其中以LowicrylK4M最为常用。LRWhite包埋剂：可加热聚合或低温紫外聚合。该包埋剂可较好保存细胞结构，反差优良。该树脂分为硬性和中性两种，硬性较为常用。K4M低温包埋的一般程序1.新鲜样品在3%甲醛和1%戊二醛的中4C下固定1~3h；2.在4C下30%、50%乙醇脱水各30min；3.在-20C冰箱中依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇脱水，每步60min；（乙醇溶液需在冰箱中预冷！）4.在-20C冰箱中依次用30%、70%、100%的LOWICRYLK4M渗透，每步120min；注意不断轻轻摇动样品使渗透完全。5.LOWICRYLK4M树酯包埋。在4C或室温下进行，尽量缩短操作时间，防止样品吸水受潮。注意包埋剂应尽量装满，否则气泡中的氧气会抑制包埋剂的聚合。6.在-20C冰箱中长紫外线照射聚合72h。室温下聚合48h。注意每天翻动2次样品使紫外光照射均匀。7.聚合后的样品应及时切片，长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而无法切片。8.超薄切片应收集在镍网、金网或铍网等惰性金属网上用于免疫金标记。LRWhite包埋剂Lowicryl树脂紫外聚合箱三、免疫金标记的方法直接标记：将所检测抗原的抗体直接包被在胶体金上，胶体金探针可直接识别抗原位点。该方法特异性好，标记位点准确，但是需要具备熟练的探针制备经验。间接标记：首先使用抗体识别抗原，再使用带有二抗或PA或PG的胶体金探针识别一抗。该方法灵敏度高，可购买商业化通用的二抗胶体金探针。但标记位点有时不是很准确。直接标记的基本步骤1.在培养皿中铺上石蜡膜(parafilm)；四周加吸水纸和水以保湿；2.加一滴ddH2O，镍网切片向下漂浮2min；3.另滴50ml封闭液(BL)，将镍网切片向下漂浮30min；4.另滴50ml封闭液(BL)，加入2-3ml胶体金探针，充分混匀；将镍网切片向下漂浮30min；5.标记后镍网的在ddH2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次，每次5-10min；晾干；6.常规染色，观察。直接标记的基本步骤间接标记的基本步骤1.镍网切片向下在ddH2O上漂浮2min。2.在封闭液(BL)上漂浮30min。3.把一抗用BL稀释100-500倍，将镍网切片向下漂浮30-60min。4.ddH2O漂洗两次各5min，除去多余一抗。5.在封闭液(BL)上漂浮30min。6.用胶体金探针标记30min。7.ddH2O上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗3次，每次5-10min；晾干。8.常规醋酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。间接标记的基本步骤通用胶体金探针的选择IgG-goldProteinA-gold探针优点缺点用途IgG保存期长(-20C,24月)精确度差分泌、细胞质定位ProteinA/G精确度高保存期短(-20C,3月)；细胞壁非特异性背景。细胞器定位四、免疫金标记的常见问题树脂聚合不好：低温导致空气水分试管内凝聚，导致脱水不彻底；或包埋胶囊空气较多，抑制了树脂凝聚。标记无特异性：样品制备过程种醛类洗脱不彻底；聚合不彻底或加速剂(氧化剂)过多；抗血清、抗体、或胶体金探针浓度过高；切片背面在胶体金探针处理完成前打湿，或镍网跌落处理溶液中。无标记：样品处理导致的抗原活性丧失；抗血清活性丧失；探针凝聚失活；或抗血清、探针过度稀释。五、免疫金标记的应用实例细胞内蛋白定位(植物抗病防卫反应蛋白)细胞壁组分定位(纤维素和几丁质)细胞壁组分定位(纤维素和几丁质)转基因表达蛋白(病毒组分)转基因表达蛋白(病毒组分)毒素作用位点定位(直接标记法)