免疫组化实验报告

1免疫组化实验报告一、仪器与试剂1.仪器：包理机：KD-BM生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；切片机：LEICA2016，德国；水浴锅：SHA-C，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；图像采集:采用OLYMPUSBX-41荧光显微镜及NIKONDIGITALSIGHT彩色CCD；数据分析软件:ImageProPlus6.0(MediaCybernetics公司；2.试剂：免疫组化染色试剂盒:Histostain-PlusMousePrimary(Cat.No.85-6643,Invitrogen,USA)Histostain-PlusRabbitPrimary(Cat.No.85-6743,Invitrogen,USA)试剂A（蓝色液体）：封闭用正常山羊血清工作液试剂B（黄色液体）：生物素化二抗工作液试剂C（橙色液体）：辣根酶标记链霉卵白素工作液DABKit(Cat.No.00-2014,Invitrogen,USA)二、石蜡包埋法1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。二．石蜡包埋的注意事项1:取材和固定：根据客户要求将切取3mm大小的组织块。2:脱水和透明：８０％酒精（min）９５％酒精Ⅰ（min）９５％酒精Ⅱ（min）无水酒精Ⅰ（min）无水酒精Ⅱ（min）二甲苯Ⅰ、Ⅱ（min）2mm45-6045-6045-6015-302-4mm60-12060-12060-120304-5mm120-240120-240120-2406023：浸蜡和包埋：浸蜡：将透明的组织放入蜡杯（Ⅰ）→蜡杯（Ⅱ）→蜡杯（Ⅲ），一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。:4：包埋：1）组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。2）准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。3）迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。4）待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。5）蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。5：切片制作：1）.室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。在夏季时可用冰块冷却刀和组织块，减少刀与组织块在过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。2）.切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放入展片仪水盒内（一般水温为45℃左右）。待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。3）.切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起破碎。6：贴片：待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以毛面轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起。三、免疫组化:1)取出并恢复至室温，PBS冲洗，3分钟×3次。2)3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，3分钟×3次。3)滴加试剂A（蓝色液体——封闭用正常血清工作液）室温孵育20分钟，倾去，勿洗。4)滴加按照：LC3:1:100,LAMP-2:1:100比例稀释的一抗放入湿盒内4℃过夜5)取出并恢复至室温，PBS冲洗，3分钟×3次。6)滴加试剂B（黄色液体——生物素化二抗工作液），室温或37℃孵育10~15分钟。7)PBS冲洗，3分钟×3次。8)滴加试剂C（橙色液体——辣根酶标记链霉卵白素工作液），室温37℃孵育15分钟。9)PBS冲洗，3分钟×3次。10)DAB显色剂显色。11)自来水充分冲洗（约5分钟）。12)苏木素复染，脱水，透明。13)中性树脂封片。3四实验结果及分析实验结果：棕黄色部位为抗原阳性表达部位。