艾滋病初筛中心实验室标准操作程序(SOP)111

成都市金牛区金建人民医院艾滋病初筛实验室标准操作程序（SOP）编号：JJYYHIV001编写者：审核者：批准者：实施日期：2014年03月12日1前言本标准操作程序（SOP）根据《全国艾滋病检测技术规范2009》的要求，由成都市金牛区金建人民医院实验室全体人员参与编写。主要起草人：钟磊，审核人：李文蓉，批准人：廖伟。根据《全国艾滋病检测技术规范2009》的要求，实验室编写了相关的SOP文件，以适应HIV抗体检测的相关需要。为全社会的艾滋病检测工作提供科学的、准确的检测服务。一些相关的制度及规范，可以为实验提供准确的结果并为实验人员及环境提供良好的保护作用。本标准操作程序（SOP）覆盖了实验室全部工作内容，主要包含以下内容：一、样品的采集、运输、接收、登记、保存、处理（编号：JJYYHIV001-01）二、检测方法和步骤（编号：JJYYHIV001-02）三、仪器的使用、维护、校准（编号：JJYYHIV001-03）四、实验中的质量控制（编号：JJYYHIV001-04）五、结果解释与报告（编号：JJYYHIV001-05）六、保密程序（编号：JJYYHIV001-06）七、检测数据的记录与保存（编号：JJYYHIV001-07）八、追踪与处理（编号：JJYYHIV001-08）九、实验室的清理与消毒（编号：JJYYHIV001-09）十、实验室的安全防护（编号：JJYYHIV001-10）本标准操作程序（SOP）至编写完成并审核通过之日起开始实施，每年由实验室主管负责组织岗位人员进行修订。所有岗位人员要在所从事工作的SOP文件上签名2并认真阅读掌握相关内容。审核人（签字）：____________目录一、样品的采集、运输、接收、登记、保存、处理…………………………………41样品接收、登记、运输及处理办法……………………………………………42样品采集…………………………………………………………………………5二、检测方法和步骤…………………………………………………………………７1检测程序………………………………………………………………………７2艾滋病抗体初筛检测常用的方法………………………………………………83丽珠试剂检测方法和步骤………………………………………………………84万泰试剂检测方法和步骤………………………………………………………9三、仪器的使用、维护、校准…………………………………………………………101仪器使用制度……………………………………………………………………102仪器设备的管理、使用、维修、报废制度……………………………………113仪器的使用、维护及校准方法与记录表样……………………………………124仪器档案………………………………………………………………………14四、实验中的质量控制………………………………………………………………151质控血清的制备和保存………………………………………………………152质控图的建立与应用…………………………………………………………16五、结果解释与报告…………………………………………………………………191HIV抗体筛查报告……………………………………………………………192HIV抗体阳性送检单…………………………………………………………193自愿咨询检测报告单…………………………………………………………193六、保密程序……………………………………………………………………………20七、检测数据的记录与保存……………………………………………………………211原始记录………………………………………………………………………212结果登记表样…………………………………………………………………213数据记录的保存………………………………………………………………21八、追踪与处理………………………………………………………………………221九、实验室的清理与消毒……………………………………………………………231HIV实验室消毒方法…………………………………………………………232HIV实验室消毒规范…………………………………………………………233HIV实验室废弃物处理规范…………………………………………………244HIV实验室废弃物处理登记表样……………………………………………25十、实验室的安全防护……………………………………………………………261实验室安全制度……………………………………………………………262实验室分区…………………………………………………………………273实验人员安全防护…………………………………………………………274标本的安全防护……………………………………………………………2941.样品接收、运送及处理办法1.1样品接收1.1.1由经过培训的、穿戴防护衣的实验人员在具有处理感染源设备的实验室内接收。装标本的包裹或容器须消毒。1.1.2核对样品与送检单，检查样品管有无破损或溢漏。若发现有破损或溢漏的应立即将尚存的标本移入新管中，对破损或溢漏的样品管进行消毒，同时报告有关领导。1.1.3检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，则应将样品安全废弃。并要将样品情况立即通知送样人。1.1.4打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。1.1.5接收样品时应填写样品接收单。1.2样品运送1.2.1实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。1.2.2应采用WHO提出的三级包装系统第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检SOP文件共2页一批准廖伟编写钟磊样品的接收、登记、处理编写日期2014-03-12修订李文蓉编号：JJYYHIV001-01修订日期2014-03-13目的掌握样品接收、运送及处理应用范围样品接收、运送及处理5单，送检单应与样品分开放置。第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发件人）。1.2.3血清和血浆样品应在2-8℃条件下由专人运送。用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下18-23℃运送。每一包装的体积以不超过50ml为宜。1.2.4运送感染性材料必须有记录。1.2.5如分离血浆仍有困难，可直接将抗凝血-20℃以下冻存，采用冰壶冷藏运输，避免冻融。1.2.6特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快专递形式投寄，但必须按三级包装系统将盛样品的试管包扎好，避免使用玻璃容器，以保证不会破碎和溢漏。1.3处理:血清、血浆标本在检测前或运送前需离心(3000转/min15min)、灭活（56℃30min）。保存期限已过的标本，需经过焚烧处理并有处理记录。1.3.1保存1.3.1.1用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8℃。1.3.1.2用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20℃以下，进行病毒RNA检测的样品如需保存3个月以上应置于-80℃。1.3.1.3用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过48h则不可检测。1.3.2废弃处理标本一般保存1年以上，过期后进行处理。采用焚烧法，有处理记录。2.样品的采集6艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液有时也可作为测试样品。常用的血液样品的采集和处理方法如下：２.1.1血清样品采集和处理２.1.1.1用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置12h，待血液凝固、血块收缩后再用3、000r/min离心15min，吸出血清备用。２.1.1.2如用滤纸片采样，则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤后，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。采血后要待血样干燥后再包装送检。２.1.2抗凝血样品采集和处理２.1.2.1用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。２.1.2.2应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如CD4+/CD8+T淋巴细胞测定可选用K3EDTA或肝素或枸橼酸钠，HIV病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠。２.1.2.3用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在48h内分离PBMC和血浆，否则应在2448h内分离血浆和血细胞。２.1.3采集样品注意事项２.1.3.1采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒说明书有特殊要求除外）。２.1.3.1采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液；直接接触HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作,应戴双层手套。7SOP文件共3页二批准廖伟编写钟磊检测方法和步骤编写日期2014-03-12修订李文蓉编号：JJYYHIV001-02修订日期2014-03-13目的熟练掌握检测方法、步骤适用范围HIV抗体检测1.检测程序样品ELISA-1阴性阳性ELISA-1+ELISA-22.艾滋病抗体初筛检测常用的方法HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验。筛查试剂：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、由临检中心批批检合格、在有效期内的试剂。筛查方法：（一）常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA）：目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法）试剂，少数使用第二代试剂。两种均阴性两种均阳性一阴一阳送确认实验室出筛查报告提供阴性咨询8我实验室使用第三代ELISA试剂，目前主要使用丽珠、万泰试剂（国家下拨）。（二）快速检测（RT）及其它检测：1、明胶颗粒凝集试验（PA）；2、斑点EIA或称斑点ELISA（dot—EIA）；3、斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验；4、艾滋病唾液检测卡；5、其它快速筛查试验方法：家庭HIV检测、尿液检测等。我实验室主要有PA试剂、胶体硒快速试剂（国家下拨）。3.丽珠试剂检测方法和步骤方法：酶联免疫吸附（ELISA）步骤:1．样品、试剂、酶标板条室温平衡30分钟。2．温育期间配制洗涤液：取20×洗涤液50ml，加蒸馏水1000ml。3.将酶联反应板从密封袋中取出，取下板条，放在板架上。按顺序编号，设一个空白对照孔，两个阳性对照孔，三个阴性对照孔。4．取阳性对照和阴性对照分别充分混匀后各50µl加入对照孔中，空白孔不加液，其余每个孔加待检血清50µl，轻轻振荡，充分混匀。并填写加样顺序表。5．用不干胶封片封盖反应板，置37℃温育30分钟。6．撕去贴膜，用洗涤液洗5次（洗板机洗，程序已编好），然后在吸水纸上拍干。7．除空白孔外每孔加酶标抗原50µl，用不干胶片封盖反应板。37℃温育30分钟。8.撕去贴膜，用洗涤液洗5次（洗板机洗，程序已编好），然后在吸水纸上拍干。9．每孔加底物缓冲液50µl，底物液50µl，轻轻振荡后置37℃避光显色30分钟。10.每孔加终止剂50µl。混匀。11．选择酶标仪450nm和620nm双波长测定，用空白孔调零点，测定各孔的吸光度。并打印结果。符合以下条件的实验成立：阴性对照平均值≤0.12阳性对照平均值﹥0.80临界值=阴性对照平均值+0.15当阴性对照平均值≤0.08时，按0.08计算。4.万泰试剂检测方法和步骤方法：酶联免疫（ELISA）步骤:1.样品、试剂、酶标板条室温平衡30分钟。92.配制洗涤液，取浓缩洗涤液50ml，加去离子水1000ml（稀释）备用。3.取HIV酶标板条，放在板架上，撕去板条上的封条。4.在确定的板孔中加入100µl的标本或阴阳性对照，震荡混匀。设1个空白对照，3个阴性对照