选修一：PCR技术

多聚酶链式反应扩增DNA片段OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5’3’3’5’碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’多脱氧核苷酸链结构简图（四）PCR(多聚酶链式反应）1、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物2、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸3、PCR原理①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化4、TaqDNA聚合酶的应用5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出6、PCR技术的特点7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液①PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸8、细胞内复制和PCR不同点②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的（五）PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合PCR循环第二步：引物与靶序列退火③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链PCR循环第三步：引物延伸第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循环后靶序列扩增的数量4、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸二、利用PCR技术扩增目的基因原理：DNA双链复制反应过程：1、加热至90～95℃目的基因DNA解链2、冷却至55～60℃，引物结合到互补DNA链3、加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从从引物起始互补链的合成利用PCR技术扩增目的基因二、PCR的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪微量离心管微量移液器1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁②注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s4、离心5、反应②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果循环数变性复性延伸第一次94°C，10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头（一）理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关2、过程①稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③计算④计算DNA含量（g）＝50x(260nm的读数）x稀释倍数50：1g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02比色杯四、课题延伸例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点五、实验小结PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃