上海理工大学微生物实验方案设计

1上海理工大学微生物学实验II实验方案设计题目：烧烤肉制品的微生物学检验学院：医疗器械与食品学院专业：食品质量与安全班级：10级食质2班姓名：王丹丹学号：1019050206组号：102012年12月2日21引言肉及肉制品在屠宰、运输、加工、储存和销售等各个环节都有可能受到环境中各种因素的影响和污染，而微生物污染尤为常见。人们如果误食了被污染的肉及肉类产品，可能会影响身体健康。在实际工作中，为了判断食品微生物污染情况，主要通过测定样品中菌落总数和大肠菌群数的多少来加以衡量。1．1实验目的：1、了解烧烤肉制品中微生物的存在2、初步建立从事微生物工作必须具有的“无菌“概念3、了解几种灭菌方法，掌握其原理及使用方法4、了解培养基的配制原理与方法，掌握其配置过程5、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术6、学习平板菌落计数的基本原理与方法7、学习微生物涂片，染色的基本技术及无菌操作技术8、认识微生物细胞的群体结构——菌落9、掌握细菌的革兰氏染色法10、掌握使用显微镜来观察细菌的方法1．2实验基本环节：1、实验仪器的灭菌2、培养基的配制3、烧烤肉制品的微生物分离及平板菌落培养和平板涂抹法4、细菌的平板菌落计数5、细菌的革兰氏染色法及细菌的观察6、仪器的清洗及整理2实验的具体操作2．1实验仪器的加压灭菌2.1.1原理：无菌操作是实验成功的必备条件。利用高压灭菌，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力的升高而增高，来提高蒸汽的温度及灭菌效率。2.1.2实验仪器：高压蒸汽灭菌器，培养皿，试管，三角瓶，玻棒，吸管，移液管2.1.3操作步骤：3用报纸将需要灭菌的仪器紧密包好，放置于灭菌器内调节杀菌温度至121℃，时间15min，压力。灭菌时间一到，等温度冷却，压力下降后，取出实验仪器。2.1.4注意事项：（1）实验仪器包扎要紧密严实，防止晃动时仪器破碎；（2）灭菌器内水分要充足，以免蒸干；（3）灭菌器内冷空气要尽量排尽，以免出现压力达要求而温度不达要求，灭菌不完全；（4）待温度冷却后再取出实验仪器，否则易使玻璃因骤冷而破裂2．2培养基的配制2.2.1原理：培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基制。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件：（1）适当组分和比例的营养物质；（2）适宜的PH值；（3）合适的渗透压；（4）保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的主要材料。培养基的配制是微生物工作者的主要技术操作之一。2.2.2实验材料：（1）药品：牛肉膏(1.5g)蛋白胨（2.5g）氯化钠（1.5g）琼脂（10g）自来水（500ml）（2）仪器及其它：电子天平、牛角匙、电炉、搪瓷杯、量筒、玻棒、三角瓶、无菌试管、培养皿、吸管、PH试纸、各种包装纸、棉花、标签、等。2.2.3操作步骤：（1）称量：按照培养基配方，正确量取各种原料放于搪瓷杯中。（2）熔化：在搪瓷杯中加入所需水量用玻棒搅拌均匀，加热溶解。（3）调PH值：用NaOH或HCl调PH，用PH试纸对照，PH控制在7.2~7.4（4）加琼脂熔化，在琼脂熔化过程中，需不断搅拌，待完全溶化后，补足所失水分。（5）将培养基倒入三角瓶中，塞上棉塞，包扎成捆，放置于灭菌箱内灭菌。2.2.4注意事项：（1）加琼脂时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦；（2）要控制好培养基的PH值；（3）棉花塞要过火杀菌。3烧烤肉制品的微生物检测分离及平板菌落培养观察3．1原理：4（1）在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了获得研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌种，获得纯培养。由于微生物可以形成菌落，而菌落是由一种个体繁殖而成的，将待测样品做一系列的稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，经过培养，形成菌落。（2）平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的。计数时，现将待测样品做一系列的稀释，再取一定量的稀释液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。（3）微生物个体微小，种类繁多且无处不有，但肉眼不可见，若用营养琼脂平板法进行检测，即可看到细胞繁殖后的群体结构，即菌落。不同的微生物形成的菌落形状不同，它是认识和鉴别各种微生物的依据之一。一般细菌在肉汁营养琼脂上的菌落形态，可从形状、大小、色泽、光泽、隆起度、透明度、表面光滑或粗糙、边缘整齐或不规则等特征加以区别。（4）在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。获得纯培养的方法，称为微生物的纯种分离法，这一过程称为微生物的分离和纯化。欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体，进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成，菌落又是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同单一菌落，再从选定的某一菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。这也就是常用纯种分离法的原理。3．2实验药品和仪器：没烤过的烧烤肉制品（生）、烤过的烧烤肉制品（烤）、无菌培养皿7付、无菌剪子1把、乳钵1个、三角瓶1个、移液管4支、试管5支、量筒、天平、接种环、酒精灯、标签纸等。3．3实验步骤：（1）取5只试管，分别标上10^(-2)（生）、10^(-3)（生）、10^(-4)（生）、10^(-2)（烤）、10^(-3)（烤）字样，每一支试管加9ml无菌水，置于试管架上；（2）取两个锥形瓶，各加45ml蒸馏水并分别标上生10^(-1)、烤10^(-1)，放到高压蒸汽灭菌锅中灭菌；5（3）分别称取没烤过的和烤过的烧烤肉制品5g烧烤制品，各自放入灭菌乳钵内研磨，磨碎后对号加入到标记好的锥形瓶灭菌水中，混匀后即为10^(-1)烧烤肉制品稀释液；（4）用无菌吸管吸取1ml10^(-1)（生）烧烤肉制品液加入10^(-2)（生）的无菌水试管中，并在试管内反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10^(-2)（生）烧烤肉制品稀释液；（5）同法，由10^(-2)（生）的试管中吸取1ml稀释液加入编号为10^(-3)（生）的无菌试管中，混匀后即为10^(-3)（生）烧烤肉制品稀释液。以此制得10^(-4)（生）、10^(-2)（烤）、10^(-3)（烤）烧烤肉制品稀释液。（6）平板菌落培养：1）取无菌培养皿4付，分别贴上“10^(-2)（烤）”、“10^(-3)（烤）”、“10^(-3)（生）”、“10^(-4)（生）”的标签；2）用4支1ml无菌吸管分别精确地吸取0.2ml10^(-2)（烤）、10^(-3)（烤）、10^(-3)（生）、10^(-4)（生）的稀释液对号放入编好号的无菌培养皿中；3）于上述盛有不同稀释度烧烤肉制品液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的培养基约10—15ml，置于水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于28～30℃温室中培养；4)培养24小时后，取出培养皿，算出菌落个数。（7）平板（涂抹）培养观察：1）取无菌培养皿2付，分别贴上“观察10^(-2)（烤）”、“观察10^(-2)（生）”的标签；2）于上述培养皿中分别倒入溶化后冷却至45℃左右的培养基约10—15ml，置于水平位置，待凝固后对号加入适量10^(-2)（烤）、10^(-2)（生）烧烤肉制品稀释液，使稀释液在培养基上均匀分布，一段时间后倒置于28～30℃温室中培养；3）培养24小时后，取出培养皿，仔细观察各皿中的菌落形态，并统计出每皿菌落数。（8）分区划线分离：1）取无菌培养皿1付，贴上“分区划线10^(-1)（生）”的标签；2）用接种环以无菌操作挑取10^(-1)（生）烧烤肉制品稀释液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约60º角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部6分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(见图3—1)，划线完毕，盖上皿盖，倒置于28～30℃温室中培养。图3-1平板划线分离的划线方法（图中1，2，3，4分别为依次划线的起点）3．4注意事项：（1）所有操作均在酒精灯周围进行；（2）烧烤肉制品稀释过程，以一支吸管由浓到稀，稀释到底；（3）花塞不可放在桌面或碰到其他杂物，一定要按照操作规程拿在手指间；（4）试管不能放在火焰上烧，免得烧破试管。（5）同一稀释度的菌数不能相差很悬殊;（6）尽量不要多数或者少数。附图：培养基菌落生长情况：10^(-2)（烤）10^(-3)（烤）710^(-3)（生）10^(-4)（生）观察10^(-2)（生）观察10^(-2)（烤）8分区划线10^(-1)生4革兰氏染色法4．1原理：（1）染色是观察微生物的一种重要方法。由于微生物细胞中含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。（2）通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。因革兰氏阳性菌细胞壁较厚，肽聚糖网层次多，交联度高，结构较紧密，用95%乙醇脱色时，肽聚糖网孔因脱水而明显收缩，加上革兰氏阳性菌的细胞壁基本上不含脂类，乙醇处理时，不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫-碘的复合物仍被牢牢阻留在细胞壁内，噬菌体呈紫色。（3）革兰氏阴性菌的细胞壁比较薄，肽聚糖网层薄，交联度低，结构较疏松，用酒精处理时，肽聚糖网孔不易收缩；但是革兰氏阴性菌的细胞壁脂类含量较高，当乙醇将脂类溶解后，细胞壁就会出现较大缝隙，使其通透性增大，所以结晶紫-碘的复合物就会被溶出细胞壁，再用番红复染时，就会显红色。4．2实验药品和仪器：结晶紫、番红、碘液、95%的乙醇、酒精灯、玻片、蒸馏水、接种环4．3实验步骤：（1）涂片：取一块洁净的载玻片，先将涂片烘烤干，在载玻片的中间滴一滴蒸馏水；将接种环在火焰上灼烧灭菌；待接种环冷却后，在“10^(-2)涂抹”的培养皿挑起菌落少许，与水滴涂匀，形成薄层，等水分蒸干后，固定涂片。（2）染色：1）初染：将涂片置于水平位置上，在涂面上滴加结晶紫染色液，染色一分钟，然后倾去染色液，用自来水细流冲洗，至洗出液中无姿色。2）媒染：先用新配的碘液冲去涂片面上的残水，再用碘液覆盖涂面媒染一分钟，然后水洗。3）脱色：除去残余水后，滴加95%的酒精进行脱色，置玻片上流出的酒精液中紫色接近消失为止（约30s钟），并立即用自来水细流冲洗，终止酒精的作用。4）滴加番红染色液，染色两分钟，水洗后用吸水纸吸干。9（3）镜检：先用擦镜纸将镜片擦干净，再调节光照，依次从低、中、高倍观察染色结果。4．4注意事项：（1）涂片时加一小滴，水太多难于干燥；（2）涂片要薄，水滴微混浊即可；（3）革兰氏染色法要严格掌握脱色程度。（4）不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏（5）镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布擦，以保证镜面的光洁度。5仪器的清洗与整理（1）将培养皿里的培养基倒入特定的地方，将培养皿清洗干净；（2）将各种玻璃仪器亲清洗干净，放入原位；（3）显微镜调好角度，放好。6实验数据与结果分析6．1平板菌落培养：菌液浓度菌落总数（个／皿形状大小色泽高度透明度边缘状况表面状况10^(-2)（生）83个圆形，其余不规则4个小的，其余比较大，一个很大滴露状、蜡质状部分凸起半透明、不透明圆形的边缘光滑呈弧形、最大的那块边缘不规则呈锯齿状乳白色较湿润、干燥10^(-2)（烤）3圆形小滴露状凸起不透明光滑呈弧形乳白色湿润7.1.1总活菌数：1ml—10^(-2)(生)烧烤肉制品稀释液中：8×100=800个101ml—10^(-2)（烤）烧烤肉制品稀释液中：3×1000=3000个7.1.2计算