高中生物课件5.3血红蛋白的提取和分离

退出目录课题3血红蛋白的提取和分离退出目录课前预习导学目标导航学习目标重点难点1.说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2.用流程图表示并体验血红蛋白的提取和分离过程。重点:凝胶色谱法的原理和方法。难点:样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。退出目录预习导引一、分离蛋白质的原理与方法1.分离蛋白质的原理蛋白质特性的差异分子的形状和大小所带电荷的性质和多少溶解度吸附性质对其他分子的亲和力退出目录2.分离蛋白质的方法(1)凝胶色谱法①概念:根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,也叫分配色谱法。②过程及原理a.凝胶形态:微小的多孔球体组成:大多数由多糖类化合物构成结构:内部有许多贯穿的通道退出目录b.分离的过程项目内容蛋白质类型进入凝胶内部通道的程度路程移动速度结果相对分子质量较小容易进入较长较慢使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离相对分子质量较大无法进入较短较快退出目录c.分离原理:依据相对分子质量的不同而将蛋白质分离。(2)电泳法①电泳的概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。②原理:利用了待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子本身的大小以及形状的不同,使带电分子在电场中产生不同的迁移速度,从而分离样品中的各种分子。③分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中后者使用时通常加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质SDS复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子的大小。退出目录3.缓冲溶液(1)组成:通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例,可配制不同pH的缓冲液。(2)作用:抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。预习交流1——缓冲溶液的成分是怎样的?缓冲溶液中含对酸碱起缓冲作用的缓冲对,每一缓冲对均由弱酸和相应的强碱盐组成。细胞外液也有酸碱缓冲对,你能回忆并说出细胞外液中的酸碱缓冲对吗?提示:细胞外液中主要的酸碱缓冲对有:H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。退出目录二、凝胶色谱法的实验操作1.蛋白质的提取和分离步骤(1)样品处理红细胞洗涤目的:去除杂蛋白方法:低速短时间离心结果:直至上清液不再呈现黄色血红蛋白的释放:红细胞在蒸馏水和甲苯作用下破裂,释放出血红蛋白退出目录分离血红蛋白溶液:混合液离心→过滤去除脂溶性沉淀层→用分液漏斗分离(2)粗分离:透析方法:将血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液(pH为7.0)中,透析12h目的:除去样品中相对分子质量较小的杂质退出目录(3)纯化:凝胶色谱法。(4)纯度鉴定:SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2.凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作(2)凝胶色谱柱的装填固定:将色谱柱垂直固定在支架上。↓装填:将用蒸馏水充分溶胀后的凝胶配成凝胶悬浮液,一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时可轻轻敲动色谱柱,使凝胶装填均匀。↓洗脱:装填完后,立即用缓冲液洗脱瓶,在约50cm高的操作压下,用300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12h。退出目录(3)样品的加入与洗脱①加样前:打开下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口。②加透析样品调整缓冲液面:与凝胶面平齐。↓滴加透析样品:用吸管将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端。↓样品渗入凝胶床:加样后,打开下端出口,等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口。退出目录↓洗脱:打开下端出口,用20mmol/L的磷酸缓冲液洗脱。↓收集:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每5mL收集一管,连续收集。3.操作提示(1)红细胞的洗涤:洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离效果。退出目录(2)色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀,可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。(3)凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。(4)蛋白质的分离:如果红色区带均匀一致地移动,说明色谱柱制作成功。退出目录预习交流2——凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱有何区别?(1)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都装填有不能通过“柱”下端多孔板(或多孔筛板)的颗粒,它们的颗粒功能有何不同?提示:凝胶色谱柱装填的是凝胶颗粒,允许小分子进入,不允许大分子进入,通过延长小分子的路程使大分子与小分子分离。固定化酶的反应柱装填的是固定有酶的载体颗粒,既能催化反应物的反应,又保证了酶与反应物分子的分离,实现了酶的重复利用,节约了生产成本。(2)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都能进行化学反应吗?提示:不是。固定化酶的反应柱能进行化学反应,凝胶色谱柱不能进行化学反应。退出目录课堂合作探究问题导学一、血红蛋白提取和分离的原理活动与探究11.分离生物大分子的基本思路是什么?提示:选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。退出目录2.蛋白质的分离和提取的原理是什么?提示:根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质与多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等分离不同种类的蛋白质。3.凝胶色谱法分离蛋白质的原理是什么?提示:当相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时,相对分子质量较大的蛋白质分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快;相对分子质量较小的蛋白质分子穿过多孔凝胶颗粒的内部通道,路程长,流动慢。因此可将相对分子质量不同的蛋白质分离。退出目录4.讨论电泳的作用及其原理是什么。提示:电泳能使带电分子向与其所带电荷相反的电极方向移动。由于待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子大小及形状不同,所以在电场中的迁移速度不同,从而实现分离。退出目录迁移与应用1用凝胶色谱法分离蛋白质时,相对分子质量大的蛋白质()。A.路程较长,移动速度较慢B.路程较长,移动速度较快C.路程较短,移动速度较慢D.路程较短,移动速度较快解析:凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。答案:D退出目录电泳方法琼脂糖凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷,各种分子在电场中迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状等在凝胶中加入SDS,使蛋白质解聚成单链。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物,使其迁移速率完全取决于分子的大小退出目录二、凝胶色谱法的实验操作活动与探究21.思考洗涤红细胞的目的和过程分别是什么。提示:(1)目的是去除血浆蛋白等杂蛋白。(2)过程:血液低速短时离心,去除上层黄色血浆→加生理盐水再离心,去除黄色上清液→如此重复洗涤三次,获得纯净的红细胞。2.在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的分别是什么?提示:加入蒸馏水是使红细胞吸水胀破,甲苯的作用是溶解细胞膜。退出目录3.观察教材图5-18,讨论血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层?如何获得血红蛋白溶液?提示:(1)分为4层:第1层为无色透明的有机溶剂(甲苯),第2层为白色的脂类物质,第3层为红色透明的血红蛋白溶液,第4层为暗红色的红细胞破碎物沉淀。(2)分层的液体→过滤除去脂溶性沉淀→分液得下层的血红蛋白溶液。4.采用何种装置进行透析?并说出透析的目的。提示:透析袋。透析袋一般是用硝酸纤维素制成的,是一种半透膜,小分子能自由进出,大分子则保留在袋内。因此透析的目的是除去小分子杂质。退出目录5.试从凝胶色谱的分离原理分析凝胶的装填要紧密、均匀的原因。提示:如果凝胶装填得不够紧密、均匀,就会在色谱柱内形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序,影响分离的效果。6.滴加样品时,应注意什么问题?提示:滴加样品时,吸管管口贴着管壁环绕移动加样,不要破坏凝胶面。退出目录7.探究样品洗脱时,红色区带可能会出现哪些情况?提示:如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确,能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流出;如果红色区带歪曲、散乱、变宽,说明分离的效果不好,这与凝胶色谱柱的装填有关。8.总结血红蛋白提取和分离的完整过程。提示:血红蛋白提取和分离的程序包括:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除相对分子质量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去,即样品的纯化;最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。退出目录迁移与应用2将经处理破裂后的红细胞混合液以2000r·min-1的速度离心10min后,离心管中的溶液分为四层,从上到下依次是()。A.血红蛋白、甲苯层、脂类物质层、沉淀层B.甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂类物质层C.脂类物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D.甲苯层、脂类物质层、血红蛋白、沉淀层解析:混合液经离心后,按密度大小排列,在离心管中从上到下依次是:第1层为无色透明的甲苯层;第2层为白色薄层固体,是脂溶性物质的沉淀层;第3层为红色透明液体,是血红蛋白的水溶液;第4层为暗红色沉淀物,主要是红细胞破碎物沉淀。答案:D退出目录1.样品处理、分离与纯化的目的不同目的红细胞洗涤去除杂质,如血浆蛋白血红蛋白释放使红细胞破裂,释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析除去样品中分子较小的杂质纯化除去相对分子质量较大的蛋白质退出目录2.分离血红蛋白溶液的结果第1层(最上层):甲苯层(无色透明)第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体)第3层(中下层):血红蛋白的水溶液层(红色透明液体)第4层(最下层):杂质沉淀层(暗红色)退出目录当堂检测1.分离蛋白质不必考虑的因素是()。A.分子的形状和大小B.蛋白质所带电荷的性质和多少C.蛋白质的溶解度D.蛋白质肽键的结构解析:所有蛋白质的肽键结构相同,均为“—NH—CO—”,不作为分离蛋白质考虑的因素。答案:D退出目录2.关于凝胶色谱法的叙述错误的是()。A.可根据相对分子质量的大小分离蛋白质B.凝胶大多数由多糖类化合物构成C.相对分子质量大的蛋白质优先离开色谱柱D.所用的凝胶是一些微小的无孔球体解析:凝胶色谱法的凝胶是一些微小的多孔球体,允许小分子蛋白质进入,不允许大分子蛋白质进入,因而增加了小分子蛋白质穿过色谱柱的距离,从而使大分子蛋白质优先离开色谱柱,从而将相对分子质量不同的蛋白质分离。答案:D退出目录3.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时,一定要加入缓冲溶液,其作用主要是()。A.使酶的活性最高B.使蛋白质的活性最高C.维持蛋白质所带的电荷D.使蛋白质带上电荷解析:蛋白质具有两性,在一定pH下,蛋白质分子的某些基团会带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。因此,加缓冲溶液的目的是维持蛋白质所带的电荷不发生改变而不是使蛋白质带上电荷。答案:C退出目录4.下列有关透析的叙述中,错误的是()。A.用于透析的薄膜要具有选择透过性B.透析膜一般是用硝酸纤维素制成的C.透析能使大分子保留在袋内,小分子自由进出D.透析可用于更换样品的缓冲液解析:透析袋一般是用硝酸纤维素(又称玻璃纸)制成的,它没有生物活性,故不具有选择透过性(活的生物膜才具有选择透过性)。透析袋能使小分子物质自由进出,而将大分子保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。答案:A退出目录5.对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作不正确的是()。A.加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B.让吸管管口沿管壁环绕移动,贴壁加样至色谱柱顶端,不要破坏凝胶面C