高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法

高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法刘萍1，侯西成2，郝满良1（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定071001；2.河北农业大学林学院，河北保定071001）摘要：介绍了高效液相色谱仪的组成，列举了使用过程中常见的技术问题和仪器故障，并对其进行分析，提出了一些解决的办法和对策。关键词：高效液相色谱仪；问题；解决方法ConmonProblemsandCountermeasureforOperationofHPLCstruementLIUPing1，HOUXi-cheng2，HAOMan-liang1(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001;2.CollegeofForestryScience,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001)Abstract:Thestructureofhighperfoananceliquidchromatography(HPLC)wasintroducedinthispaper.ItillustratesthecommonpromblansandtroubleinHPLCanalysis,andgivestherespectivelytoexchangeexperiencewithotherHPLCanalysis.Kevwords:HPLCirrstrumen;problem;resolvent高效液相色谱法(Highperfomanceliquidchromatography,HPLC)是20世纪60年代末迅速发展起来的一种新型分离技术。它以经典液相色谱为基础,采用了高压送液泵、微粒型填料和各种高灵敏度检测器。因此,具有适用范围广、分离效率高、分析速度快、流动相可选择范围宽、检测灵敏度高、色谱柱可反复使用、流出组分容易收集等优点[1]。目前,在医药卫生、食品、环保等各个领域已得到了广泛的应用。世界各国已将该法收载于药典[2-4]。高效液相色谱仪在使用过程中,难免会出现各种各样的问题,并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因,即可清楚预防和排除这些故障的方法,就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。1.高效液相色谱仪系统高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的仪器设备，其基本单元组成如图1所示，是由溶液贮液器、泵、进样器、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成[5]。图1高效液相色谱仪器的组成高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算，从而完成整个分析过程[6]。2.常见问题及其解决方法2.1柱压问题所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在345kPa以内(在使用梯度洗脱时,柱压平稳、缓慢的变化是允许的）[7]。压力过高、过低都属于柱压问题,缩短色谱柱的使用寿命。溶液贮液器泵进样器色谱分离柱检测器记录仪控制系统和数据处理系统自/手动进样器器表1柱压变化的原因及解决方法出现情况原因解决方法柱压高于正常值色谱柱被堵塞、流速设定不正确、系统压力零点飘移更换新的色谱柱、重新设定正确流量、调节压力传感器的零点。进样器、柱端过滤器、管路或连接口堵塞拆下过滤器用硝酸超生清洗、更换被堵塞管路或按说明书方法进行清洗。流动相配比不正确重新设定配比长期使用柱端固定相板结挖掉板结部分修补柱端分析生化、染料等易污染固定相的样品方法同上，采用保护柱柱压低于正常值某连接处泄露打高压300bar查找泄露处，拆下柱子加适当力拧紧或衬四氟薄膜泵里进空气打开Purge阀，用３-５ml/min的流速冲洗没有流动相流出检查储液瓶中有无流动相、沉子是否浸没在流动相中、泵是否运行。参比阀未关闭将流速降低后关闭参比阀，一般降至0.1～0.2ml/min后关闭参比阀2.2基线噪声和漂移噪声和漂移是检测器稳定性的主要表现。2.2.1基线噪声较大和对策对于紫外检测器，氘灯光源打开后要预热３０分钟以上，基线才能稳定[8]。噪声是指与被测物无关的检测器输出信号的随机扰动变化，分短期噪声和长期噪声两种。氘灯用的过久，接近受命期时（氘灯的寿命约束１０００小时），会使基线噪音明显增加，应及时更换氘灯。除光源外，流路中的气泡也会产生噪音。怎样判断基线噪声增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡？可将泵关上，继续走基线，如果噪声立即停止，基线呈一条直线，说明基线噪声来自流动相中的气泡，应设法排气；若停泵后仍有噪音出现，应考虑是灯的问题。电化学检测器中的工作电极（安培型）对气泡十分敏感，仪器的平衡时间较长。流路中如果有气泡存在，不仅基线会出现尖峰，还会影响检测。因此，做电化学检测时，流动相的配制要很严格，水要超纯、除还原物，配好后一定要过滤脱气，还应现用现配。如果泵系统不是ＰＫ材料，即电化学分析专用仪器，而是普通的高效液相色谱不锈钢泵，应对系统中的不钢材料的输液泵、进样器和管道，在分析前用6mol/L硝酸溶液钝化（注意断开分离柱），可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入ＥＤＴＡ离子隐蔽剂，也是可以的。如果有较大的气泡进到检测器中，光靠泵冲有时太慢，可暂时将泵停止，关上电化学检测器，拆下工作电极，用超纯水冲洗电极表面，也很奏效的，但对液相色谱技术不太熟练的技术员要小心操作，不宜反复这样拆卸。2.2.2基线漂移一般说来，机器刚启动时，基线容易漂移，大概要30min的平衡时间，如果在实验过程中发现基线漂移，则要考虑下面的原因（见表2）。表2基线漂移的原因及解决方法原因解决方法柱温波动控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱流通池被污染或有气体用甲醇或其它强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子），如有需要，可以用１mol/L的硝酸（不要用盐酸）冲洗紫外灯能量不足更换新的紫外灯流动相污染、变质或由低品质溶剂配成检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及ＨＰＬＣ级的溶剂样品中有强保留的物质（高Ｋ′值）以馒头峰样使用保护柱，如有必要，在进样之前；在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子检测器没有设定在最大吸收波长处将波长调整至最大吸收波长流动相的ｐＨ值没有调节好加适量的酸或碱调至最佳ｐＨ值,对于硅胶基质的填料,其所能承受的流动相范围约为1~8[9]2.3保留时间漂移保留时间的改变也是很多液相色谱仪使用者常碰到的问题，简单概括如下表3。表3保留时间漂移的原因及其解决方法原因解决方法柱温控制不当设定一个恒定的温度，调好柱温流动相的问题使用预混合则要注意每次配液的准确性、精密度与ｐＨ值的变化；流动相被污染或加入添加剂后可能对待测组分存在干扰。色谱柱没有平衡或被污染在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱（至少为0.5～1ｈ，在改变流动相时也需要0.5ｈ）或更换新色谱柱。流动相的问题使用预混合则要注意每次配液的准确性、精密度与ｐＨ值的变化；流动相被污染或加入添加剂后可能对待测组分存在干扰。流速变化重新设定流速泵中有气泡从泵中除去气泡2.4异常峰形异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况[10]。具体问题具体分析，根据出现问题峰的原因采取不同的解决方法。（见表4）表4异常峰形及其分析出现情况分析及解决方法色谱图中未出峰系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确。针对以上情况成因作相应调整即可所出峰比预想的小样品黏度过大；进样故障或进样体积误差；检测器设置不正确；定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题一个峰或几个峰是负峰流动相吸收本底值高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相所有峰均为负峰信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡所有峰均为宽峰系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确;色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响出现双峰或肩峰进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护柱或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道鬼峰进样阀有残余，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用ＨＰＬＣ级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除拖尾峰柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相ｐＨ值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；使体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生平头峰检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高前伸峰进样大或样品浓量度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效以上从几个方面简介了高效液相色谱仪的常见问题及解决方法。在日常工作中,如果能对这些事项认真对待,做到有问题及时解决,则会大大延长仪器的正常使用期限,并使仪器的性能得到最大限度的发挥，保证检测的准确性，降低检测成本。参考文献：[1]张君仁,藏恒昌.体内药物分析[M].北京:化学工业出版社,2002.1255[2]TheUnitedstatespharmacopeialconvention,Inc,TheUnitedstatespharmaXXll[S].Appendix.1774-1777[3]Britishpharmacopoeiacommission,Britishphavmacopia[S].Appendix,2002.140～144[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2000.附录32-34[5]邹汉法，张玉奎，卢佩章编著.高效液相色谱法[M].北京：科学出版社,2001.301-325[6]林炳承等.高效液相色谱在生命科学中的应用[M]．山东：山东科技出版社，1996．[7]黄加龙.高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法[J].饲料工业，2006，27（15）：34-35[8]张燕婉，孟宪敏.高效液相色谱仪使用中常见问题及对策[J].中国医学装备，2006，3（4）:31-33[9]刘国诠,余兆楼.色谱柱技术[M].北京:化学工业出版社,2001.119-36[10]陈莲,高洪,肖啸.高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法[J].动物科学与动物医学,2005,(5):8-10附:第一作者;刘萍(1981-),女汉河北省保定市河北农业大学西校区动物科技学院临床兽医2004研在读研究生邮编:071001手机:[phone]email;[e-mail]通讯作者;郝满良:（1959-），男，汉副教授主要从事临床兽医学和动物疾病非特异防控的教学与研究河北省保定市河北农业大学西校区动物科技学院邮编:071001手机:130120772110312-7528350email;[e-mail]