高效液相色谱使用指南

e高效液相色谱知识收藏Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法液相色谱柱使用及保养高压液相色谱HPLC培训教程(一)高压液相色谱HPLC培训教程(七)高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生HPLC对流动相的基本要求高效液相色谱Waters600E-2487HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程高效液相色谱仪(Agilent1100)操作注意事项色谱扫盲班2Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤(一)、开机：1、打开计算机,进入WindowsNT（或Windows2000）画面,并运行BootpServer程序。2、打开1100LC各模块电源。3、待各模块自检完成后，双击Instrument1Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。4、从“View”菜单中选择“MethodandRuncontrol”画面,单击”View”菜单中的“ShowTopToolbar”，“Showstatustoolbar”，“Systemdiagram”,”Samplingdiagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。5、把流动相放入溶剂瓶中。6、打开Purge阀。7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入泵编辑画面。8、设Flow：5ml/min，单击OK。9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pumpcontrol选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭Purgevalve。11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：1.0ml/min。12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。（二）数据采集方法编辑：1、开始编辑完整方法：●从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项，如上图所示选中除“Dataanalysis”外的三项，单击Ok，进入下一画面。2、方法信息：●在“MethodComments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。●单击Ok进入下一画面。3、泵参数设定：（以二元泵为例）●在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“SolventB”处输入70.0,(A=100-B),也可Insert一行”Timetable”,编辑梯度。在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。●单击Ok进入下一画面。4、自动进样器参数设定:●选择合适的进样方式,进样体积1.0ul,洗瓶位置为6号。“StandardInjection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“InjectionwithNeedleWash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Useinjectorprogram”---可以点击Edit键进行进样程序编辑。●点击Ok进入下一画面。5、柱温箱参数设定:●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more”键,如图所示,选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。●点击ok进入下一画面。36、VWD检测器参数设定:●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在”Peakwidth(Responsetime)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间,如0.1min(2s)。●在Timetable中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。点击ok进入下一画面。7、DAD检测器参数设定:●检测波长:254nm,BW=30nm,参比波长=350nm,BW=100nm;●检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peakwidth（Responsetime）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit—狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。●点击Ok进入下一画面。8、RID检测器参数设定:●色谱条件:进样体积:20ul。光学单元温度:Off。极性:正。峰宽(响应时间):4s。●“OpticalUnitTemperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off,若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“Peakwidth”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。“Automaticrecyclingafteranalysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。●点击RID图标，选择RIDControl：Heater设为On，若要循环流动相，必须将“RecyclingValve”设为ON。手动purge参比池，将其设为On，并输入Purge时间。9、FLD检测器参数设定:色谱条件：●样品：P/N01018-68704用甲醇稀释为1:10。●进样体积：5ul。●柱温箱:30℃。EX=246nm,EM=317nm,PMT=10。●响应时间=4s.停止时间：出峰完毕。●ExcitationA:激发波长:200-700nm,步长为1nm,或ZeroOrder。●Emission:发射波长:280-900nm,步长为1nm,或ZeroOrder。●PMT:大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少PMT值。●“Peakwidth”：大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设定值。●MultiEx：多波长及光谱（激发）。●MultiEm：多波长及光谱（发射）。●同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。10、在“Runtimechecklist”中选中“Dataacquisition”，单击Ok。11、单击“Method”菜单，选中“Savemethodas”，输入一方法名，如“test”，单击Ok。412、从菜单“View”中选中”Onlinesignal”,选中Windows1,然后单击Change钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows2)。13、从“Runcontrol”菜单中选择“Sampleinfo”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Datafile”中选择“Manual”或“Prefix”。区别:Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。Prefix—在Prefix框中输入前缀，在Counter框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。14、从Instrument菜单选择Systemon。15、等仪器Ready，基线平稳，从Method菜单中选择“Runmethod”，进样。（三）、数据分析方法编辑:1、从“View”菜单中，单击“Dataanalysis”进入数据分析画面。2、从“File”菜单选择“Loadsignal”，选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok。3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signaloptions”选项，。从Ranges中选择Autoscale及合适的显示时间，单击ok,或选择”UseRanges”调整。反复进行，直到图的比例合适为止。4、积分:(1)、从“Integration”中选择“Autointegrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“IntegrationEvents”选项，选择合适的Slopesensitivity，Peakwidth，Areareject，Heightreject。(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项，则数据被积分。(3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。(4)、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。5、打印报告:(1)、从“Report”菜单中选择“Specifyreport”选项，进入如上画面。(2)、单击“QuantitativeResults”框中Calculate右侧的黑三角，选中Percent（面积百分比），其它选项不变。(3)、单击Ok.(4)、从“Report”菜单中选择“Printreport”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report底部的“Print”钮。(四)、关机:●关机前，用100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]●退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shutdown关）。关掉Agilent1100电源开关。Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。54、带seal-wash的1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。维护知识问答1、为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头的类型：30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.清洗液配制:90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。3、为什么Agilent1100LC的流动相管路非常细?在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的