高三生物测试题30

基因工程和蛋白质工程撰稿：李文强责编：苏晨辉章节概述基因工程是生物工程的核心技术，是当前生命科学研究的热点和前沿，因而各地高考命题均以此作为命题重点，常以材料分析题、选择题等形式出现。从其地位来看，继续作为命题热点的可能性不会改变。蛋白质工程主要是工业生产和基础理论研究的需要，而结构生物学对大量蛋白质分子的精确立体结构极其复杂的生物功能的分析结果，为设计改造天然蛋白质提供了蓝图，分子遗传学的以定点突变为中心的基因操作技术为蛋白质工程提供了手段。目标认知学习目标1．简述基因工程的原理及技术、举例说明基因工程的应用。2．关注基因工程的发展，认同基因工程的应用促进生产力的提高。3．尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案。重点1．DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。2．基因工程基本操作程序的四个步骤。3．蛋白质工程的原理。难点1．基因工程载体需要的条件。2．从基因文库中获取目的基因。3．利用PCR技术扩增目的基因。知识精讲重点知识讲解基因的结构原核生物的基因组成：原核生物基因分为编码区与非编码区。编码区与非编码区的定义及位置：所谓的编码区就是能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质。非编码区则相反，但是非编码区对遗传信息的表达是必不可少的，因为在非编码区上有调控遗传信息表达的核苷酸序列。非编码区位于编码区的上游及下游。在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。RNA聚合酶催化DNA转录为RNA，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。真核生物的基因组成真核细胞的基因也是由编码区和非编码区两部分组成的（如下图）。在非编码区上，同样有具有调控作用的启动子和终止子，但是真核细胞的基因结构要比原核细胞的基因结构复杂。与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。基因工程的“剪刀”和“针线”（1）限制性核酸内切酶——剪刀在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，但对自己的DNA没有损害作用。由于这种切割作用实在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶，简称限制酶。限制酶是基因工程中重要的切割工具，科学家已经从原核生物中分离出了许多种限制酶并且已经商品化，在基因工程中广泛使用。根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位没有特异性；另一类是可以特异性的识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。限制酶在特定切割部位进行切割时，按照切割的方式，又可以分为错位切和平切两种。错位切一般是在两条链的不同部位切割，中间相隔几个核苷酸，切下后的两端形成一种回文式的单链末端，这个末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结，故称为黏性末端。这种酶在基因工程中应用最多。另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。如下图所示：限制性核酸内切酶根据其功能可分为一级和二级两大类。在基因重组方面广泛使用的是二级，一般情况下识别由4~8个碱基构成的特定序列有选择地将其切断。一级限制性核酸内切酶则跟特定的碱基序列结合，切断位置上不具有特异性。以典型的二级限制性核酸内切酶EcoRI为例，识别5’-GAATTC-3’这一序列（双链中的另外一条链为3’-CTTAAG-5’）将各链上连接G（鸟嘌呤）和A（腺嘌呤）之间的磷酸二酯键切断生成两个DNA的断片。如图所示：（2）DNA连接酶——针线它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。噬菌体T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端，而大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，但NH4C1可以提高在的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。限制性核酸内切酶与DNA连接酶比较酶的种类作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于基因表达载体的构建DNA聚合酶与DNA连接酶比较比较项目DNA聚合酶DNA连接酶不同点形成磷酸二酯键的方式只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个脱氧核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键是否需要模板以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因DNA连接酶不需要模板是否参与基因工程没有参与在基因工程中，DNA连接酶可以作为连接运载体和目的基因的“针线”相同点①它们的化学本质都是蛋白质。②两者均属于酶，具有酶的基本属性和特点。③两者都能形成磷酸二酯键，即在相邻核苷酸的3位碳原子的羟基与5位碳原子上所连接的磷酸基团的羟基之间形成。④两者均参与DNA的复制、逆转录等过程。目的基因的获取（1）从基因文库获取基因基因文库：用重组体DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体的所有片断随机连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中。通过细胞增殖而构成各个片断的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。可以分为DNA文库和cDNA文库。真核生物的cDNA文库中的目的基因是根据mRNA反转录获得的，所以不含有内含子序列，而DNA文库的目的基因是含有内含子序列的。注意基因文库与基因库和基因克隆的区别：基因库是指一生物群体中的全部基因。基因克隆是只包含单个基因或DNA片段的克隆。（2）PCR技术扩增目的基因PCR是聚合酶链反应，它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的聚合及扩增。它包括3个基本步骤：（1）变性：目的双链DNA片段在94℃下解链；（2）退火：一对寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板DNA的目的序列通过氢键进行碱基配对；（3）延伸：在热稳定DNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以目的DNA为模板、引物、dNTP、适宜缓冲液（Mg2＋）的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是以上述三步反应为循环完成的。由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物是以指数方式增加，理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍。虽然在开始几个循环中含有长短不一的产物，但在以后的循环直至最终产物中是以两个引物界定长度的DNA片段为主。经过20个循环后，特定DNA片段的数量在理论上可增加106倍，从而实现了体外DNA分子的大量迅速扩增。图示如下（3）人工合成目的基因化学合成法：根据蛋白质肽链的氨基酸顺序推知遗传密码，用化学方法人工合成基因。如tRNAala的DNA双链的人工合成：（1）先合成多核苷酸小片段。（2）在缓慢冷却过程中，互补区，段形成双链。（3）添加连接酶，促使小段多核苷酸互相连接。反转录酶法：经反向转录酶的作用，以mRNA获得与mRNA顺序互补的DNA单链，然后再复制形成双链DNA（cDNA）。例如人的胰岛素和血红蛋白的基因、蚕的丝心蛋白基因。反转录操作步骤：基因工程中的运载体在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。作为运载体必须具有三个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个可适于多种限制酶切割的DNA插入；③有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改造。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。由质粒的构建的表达载体模型如图所示：不同受体细胞的转基因方法及检测生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子检测方法分子水平检测（1）检测目的基因是否存在：DNA分子杂交（2）检测是否转录出mRNA：DNA-RNA分子杂交（3）检测是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交个体水平检测目的基因是否表达（1）抗病抗虫接种实验（2）对基因产品与天然产品的功能进行活性比较基因诊断采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断，是病因的诊断。有DNA诊断和RNA诊断两种方法。DNA诊断检测相关基因的结构及其表达功能（特别是RNA产物）是否正常。RNA诊断对表达产物mRNA质和量表化的分析。基因诊断的特点：①以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。②分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的特异性。③分子杂交和聚合酶链反应都具有放大效应，诊断灵敏度很高。④适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为外源基因。基因诊断的应用（1）遗传疾病（2）感染性疾病①病毒性感染②细菌性感染③寄生虫（3）恶性肿瘤（4）法医学中的应用如DNA指纹分析在鉴定犯罪证据方面的应用。经典例题透析1．有关基因工程的叙述正确的是A．限制酶只在获取目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．质粒都可以作为运载体D．蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索考点定位：本题主要考查从基因文库中找到所需要的基因。指点迷津：在基因工程中，不仅要用限制酶切割目的基因，还要用同一种限制酶在质粒上切割出一个切口，使目的基因与质粒切口的黏性末端能进行碱基互补配对，所以A错；重组质粒是在细胞外进行的，所以B错；并不是所有的质粒都可作运载体，在科学研究中，人们通常只是用大肠杆菌的质粒（其上有抗药基因）作运载体，所以C错；在人工合成目的基因的方法中，有一种方法是根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，最后通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。基因文库中的基因的来源，有的是从自然界获取的，有的是人工合成的。参考答案：D2．（11浙江）ada（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD．每个人的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子考点定位：本题考查基因工程的相关知识。指点迷津：将重组质粒导入大肠杆菌并成功表达，说明大肠杆菌内至少含有一个重组质粒；每个重组质粒都含有目的基因ada，则该重组质粒至少含一个能被该限制性内切酶切割的位点；限制性核酸内切酶具有特异性