染色体工程与植物育种

第三章染色体工程与植物育种植物染色体工程的用途十分广泛，主要用在基因定位和异源基因的导入。我国自80年代开始进行染色体工程育种研究，经过“六五”和“七五”协作攻关，在小麦染色体工程育种方面有较大进展，创制了小麦与黑麦(Secalecereals)、山羊草(Aegilopstauschii)、簇毛麦(Haynaldiavillosa)、大麦(Hodeumvulgare)、类麦(Thinopyrum)等近缘种、属的双二倍体，转育了不同生态型的小麦单体系统和缺体系统，选育出了多种异附加系、异代换系和易位系。这是一批十分有用的染色体工程基础材料，是选育小麦良种的宝贵资源。本章内容提要第一节染色体工程的一般概念和主要内容第二节染色体组水平的操纵技术第三节染色体水平的细胞遗传学操纵第四节染色体片段的细胞遗传学操纵第五节染色体微切割和人工染色体第六节染色体工程和作物育种第一节染色体工程的一般概念和主要内容一、概念二、亲缘关系远近与遗传操作策略三、染色体的操纵的三个水平一、染色体工程概念该术语最早由里克（Rick）和库升（Khush）于1966年在论述番茄单体、三体和缺体时提出的。染色体工程：按照人们预定目标，采用一定的方法和步骤，通过染色体操纵改变生物染色体组，并进而改变其遗传性的过程。——陈佩度染色体工程：是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的一种技术。——李志勇染色体工程：指某一种植物的染色体或染色体片段按照人们的意愿进行添加、消减、代换或易位，从而达到定向改变植物遗传性的一项技术。——陈耀锋陈佩度本课教材编者狭义和广义染色体工程：狭义：指人工分离染色体或染色体片段，导入受体原生质体，再经过原生质体培养再生细胞壁、愈伤组织，直至再生出完整植株的过程。广义的还应包括应用细胞遗传学技术通过有性杂交和回交、细胞组织培养和体细胞杂交等方法，按预定目标有计划有步骤地转移染色体组、染色体或染色体片段。注：导入的染色体必须是有活力的，导入原生质后，又涉及到如何与受体染色体“共处”或“重组”问题。染色体工程在培育抗病新品种上有重要意义，而且是基因定位和染色体转移等基础研究的有效手段。染色体组：生物体内维持生命活动所必须的一套非同源染色体（用x表示），它是遗传的生命单位。部分同源群：分别处于不同染色体组中，最早可能由同一条染色体演化而成的，具有不同程度同源关系的染色体互称为部分同源染色体并共同组成一个部分同源群。它们具有基本相似的核苷酸组成和排列次序，相互之间具有一定的补偿性。染色体组和部分同源群二、亲缘关系远近与遗传操作策略1、含有同源染色体组物种间的遗传操纵特点：有性杂交容易成功，F1雌雄配子的育性较好策略：采用一般的有性杂交技术，如果双亲间遗传性状差异大，要加大杂种群体、增加选择代数、或辅以花药花粉培养等技术诱导单倍体，然后加倍，加速形成纯合体。2、含有部分同源染色体组物种间的遗传操纵特点：没有相同的染色体组，但具有部分同源关系，有性杂交有难度，杂种后代双亲染色体间很少或基本不配对。策略：通过回交，育成异附加系或异代换系；通过操纵染色体配对控制体系（如小麦5B），可促进具有部分同源关系的染色体间配对，发生交换和重组；也可以通过理化因子或生物因子（如小麦近缘种中的杀配子基因）诱导染色体断裂、重接，产生易位。3、无同源染色体组物种间的遗传操纵特点：无同源性，有性杂交极其困难，或至今得不到有性杂种。策略：采用体细胞杂交技术获得体细胞杂种。三、染色体操纵的三个水平1、染色体组操纵：添加或消减同种或异种染色体组，合成双二倍体或部分双二倍体，或者创造单倍体。2、染色体操纵：整条染色体的附加、消除、代换，导入的染色体要有完整的着丝粒和端粒，以保持其结构稳定性和进行正常的复制分裂。3、染色体片段操纵：指染色体片段的转移→易位、添加或消除。需要经过染色体断裂和重接，新形成的染色体具有且只具有一个着丝粒，而且染色体两端形成完好端粒。在育种中，不仅要求整组染色体、整条染色体或染色体片段的操纵成功，还要求经操纵后的个体在细胞遗传学上的稳定性，在遗传组成和形态特性上比原有亲本更加优良。（补充）染色体变异染色体结构变异①染色体易位：一个染色体上某一区段与另一非同源染色体上的区段发生互换。②染色体缺失：染色体的某一区段及其带有的基因一起丢失。③染色体倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转。④染色体重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。（补充）染色体变异染色体数变异①一是体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，以整倍体染色体数目变化产生的变异会产生多倍体和单倍体；②另一种是染色体组内的个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的的完整倍数，因此被称为非整倍体。第二节染色体组水平的操纵技术一、远缘杂交障碍及克服途径二、染色体组的消减：即单倍体产生和二倍体化三、染色体组的添加——异源多倍体、同源多倍体等一、远缘杂交障碍及克服途径障碍：花粉萌发不好、花粉管伸长缓慢、雄配子不能顺利通过珠孔进入胚囊壳完成受精、远缘杂种的某亲本的染色体全部或部分消失、杂种灭亡和杂种不育。克服途径：使用失活的母本花粉、生长素类物质（2，4—D）或利用可交配基因和桥梁亲本，采取幼胚拯救和染色体加倍等措施。二、染色体组的消减：即单倍体产生和二倍体化1、单倍体：含有配子染色体数目的孢子体。单倍体包括：（1）整倍体单倍体：一倍体、多倍单倍体（同源多倍单倍体、异源多倍单倍体）（2）非整倍体单倍体：二体单倍体（n+1）、附加单倍体（n+1′）、缺体单倍体（n-1）、置换单倍体（n-1+1′）2、单倍体的产生①自然产生：双生苗（多胚现象）、半配合（精、卵各自分裂→嵌合体）②诱发产生：远源杂交诱导、延迟授粉、单倍体的诱发基因（大麦中的hap基因）和核质互作、利用合子发育过程中染色体消减，以及花药、花粉核未授粉的子房、胚珠培养等。3、二倍体化可自然加倍，但频率很低，一般需要人工加倍。目前最常用的方法是用秋水仙素处理在细胞分裂时期的分生组织，使其新生器官的染色体加倍。4、单倍体在育种上的应用（1）提高选择效率，加速育种进程，因为单倍体的基因型核表现型是一致的，对于隐性基因控制的性状特别有效，常规杂交育种需要8～10年，而单倍体育种只须一个世代即可得到纯合二倍体。（2）加速纯系的获得，尤其对于玉米等异花授粉作物杂种优势利用来说具有特别重要意义。（3）利用花粉植株进行异源染色体或基因的转移，例如：小黑麦（AABBRR）×小麦（AABBDD）→F1（AABBRD）→R、D两组单体在减数分裂过程中将以0～7的各种可能出现于子细胞中。通过花粉培养可得到类型丰富的花粉植株，这些植株在遗传育种中具有重要的研究利用价值。（4）利用单倍体进行突变体的选择，由于单倍体没有显隐性关系，所以无论是培养过程中引起的体细胞变异还是在人工诱导产生的突变体，特别是隐性突变体，均可以有效地表现出来。5、单倍体育种的不足（1）基因重组的机会只有一次，缺少常规杂交育种各个分离世代的基因交换与重组的机会，后代不能积累更多的优良基因。（2）单倍体诱导技术还不是很完善，花培出愈率和绿苗率均较低，单倍体群体小，很多优良基因可能被淘汰。三、染色体组的添加——异源多倍体、同源多倍体等多倍体（polyploid）这个名词是由Winkler（1916年）首先使用的，它是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。染色体组成多倍性现象在高等植物中相当多，但动物界的多倍体现象却少得多。自从60年代发现一种美洲角蛙是一个确定的四倍体动物以来，学者们陆续在低等脊椎动物中发现许多多倍体动物，包括鱼类、两栖类和爬行类。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视染色体组的添加可以自然发生，也可以人工诱导合成1、异源多倍体：在正常二倍体染色体组的基础上添加一个至多个异种染色体组的个体。如：小麦、燕麦、棉花等典型的例子是普通小麦和小黑麦一粒小麦（AA）2n＝14×？（BB）AB染色体自然加倍二粒小麦（AABB）2n＝28×节节麦（DD）2n＝14ABD染色体自然加倍普通小麦（AABBDD）2n＝42普通小麦AABBDD×黑麦RRABDR（不育）染色体加倍AABBDDRR八倍体小黑麦硬粒小麦（AABB）×黑麦（RR）ABR（不育）染色体加倍AABBRR（六倍体小黑麦）2、同源多倍体：在正常二倍体的染色体基础上添加一个至多个同种染色体组的个体。如：马铃薯等同源多倍体在有利基因剂量效应对植株的生长量和某些生物产物有促进作用。如三倍体甜菜、橡胶、香蕉、西瓜、草莓等。典型例子：三倍体无籽西瓜3、同源异源多倍体（如AAAAGG）是介于同源多倍体和异源多倍体之间的过渡类型。典型例子：三倍体无籽西瓜二倍体西瓜（BB2n＝2x＝22）0.2%秋水仙素处理生长点四倍体西瓜（BBBB）♀×二倍体西瓜♂三倍体西瓜（BBB）（*不育，不结籽，在外界花粉刺激下可结实）四、人工诱导多倍体的方法生物学方法Rasch等（1965）年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过杂交产生，他们将雌核发育的二倍体帆鱂（Poeciliaformosa）与P.Vittate杂交，得到三倍体后裔。雌性草鱼（2n=48）与雄性三角鲂（2n=48）杂交获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体，其中草鱼提供了二倍数目的染色体（48），三角鲂提供了单倍数目的染色体（24）。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。物理学方法温度休克法：包括冷休克法和热休克法两种，即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。此法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于养殖场大规模生产使用。水静压法：就是采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。此种方法诱导率高（90%~100%）、处理时间短（3~5min），对受精卵损伤小、成活率高。但该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产。化学方法细胞松驰素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。秋水仙碱：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。其它药物：N2O和聚乙二醇等。五、多倍体倍性鉴定的方法核体积测量：二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5，二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。蛋白质电泳：生化分析：如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体。染色体计数：是鉴定多倍性的一个准确的直接方法。DNA含量测定：流式细胞仪。染色体直接计数法准确、直接，但费时；红细胞体积测量法省时、简单，在生产现场就能进行而广为人们采用，但缺乏准确性，亦测不出嵌合体，往往需要校正；DNA含量测定法是较为先进常用的方法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但需要特殊的仪器设备。六、多倍体动物的应用及发展趋势多倍体动物的生活力及生长能力。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良好的生存力和生长率。诱导三倍体可以增加种间杂种的成活率，三倍体种间杂种可以比二倍体杂种成活得更好一些。多倍体动物的性腺发育及其应用三倍体预期是不育的，许多实验也都证明了这一点。生产上可以利用这个不育特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长上，避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，也避免了生长停滞和死亡率的增高，缩短了养殖周期、减少了养殖成本，可养成大型个体。与三倍体不同，四倍体是可育的。目前如何大量诱导四倍体并培育至性成熟，尔后与正常二倍体杂交获得不育的三倍体，进行三倍体育种是许多学者正在致力研究的课题。多倍体动物的其它经济性状三倍体虹鳟的鱼肉质量确实优于二倍体，其抗传染性造血器官坏死病毒能力较强；三倍体大西洋鲑耐低氧，故可适用于低氧环境养殖；三倍体香鱼对声音和光线的感受能力