高良姜药材中4种有效成分的含量测定

高良姜药材中4种有效成分的含量测定【摘要】目的建立评价高良姜药材质量的含量测定方法。方法采用DiamonsilTMC18柱(4.6mm×200mm，5μm)，流动相为乙腈磷酸溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长为220nm。结果：高良姜素、山柰素甲醚、5羟基羟基甲氧苯基)苯庚酮、5羟基双苯庚酮的线性范围分别为0.267～1.328μg、0.1034～0.517μg、0.3108～1.5540μg、0.2473～1.236μg，平均回收率分别为100.9%、97.0%、96.8%、99.0%，RSD值分别为1.7%、1.4%、1.8%、0.6%。结论该方法准确、简便，具有良好的重复性和稳定性，可用于高良姜药材的质量控制。【关键词】高良姜;高效液相色谱法;黄酮;庚烷;质量控制Abstract:ObjectiveTodevelopanHPLCmethodforcharacterizingtheactiveconstituents,namely,galangin,kaempferolanddiphenylheptaneC,inAlpiniaofficinarumHance.MethodSampleswereanalyzedonanHPLCDiamonsilC18column(200mm×4.6mm，5μm)byusinggradientelutionofacetonitrile(A)and0.2%aqueousphosphoricacid(B)ataflowrateof1.0mL·min-1.ThediodephenylheptaneAanddiphenylheptaneChadgoodlinearityovertherangesof0.267-1.328，0.1034-0.517，0.3108-1.554and0.2473-1.236μg，respectively,andtheaveragerecoverieswere100.9%(RSD=1.7%)、97.0%(RSD=1.4%)，96.8%(RSD=1.8%)and99.0%(RSD=0.6%)，respectively.ConclusionThemethodisrapid，accurateandreproducible,whichishelpfulinthequalitycontrolofAlpiniaofficinarumHance.Keywords:AlpiniaofficinarumHance;HPLC;flavonoids;diarylheptanoids;qualityevaluation高良姜为姜科山姜属植物高良姜AlpiniaofficinarumHance的干燥根茎，其性热味辛，归脾、胃经,具温胃散寒、消食止痛的功效，用于脘腹冷痛、胃寒呕吐、嗳气吞酸等[1]。高良姜黄酮和庚烷均具有调节钙离子释放、抗氧化应激、抗炎、调节免疫、抗病原微生物、抑制平滑肌刺激收缩、镇痛止呕等药理作用[2～5]。高良姜含有十多种黄酮类成分[6]和十多种二苯基庚烷类物质[7]，其中高良姜素、山柰素甲醚、5羟基羟基甲氧苯基)苯庚酮(DPHA)、5羟基双苯庚酮(DPHC)含量比较高，因此本文选择这4个成分作为监控指标，采用HPLC法同时测定不同批号和来源的高良姜药材中的以上的2种黄酮类成分和2种庚烷类成分的含量，为全面准确控制药材质量提供了可行的依据。1、仪器、试剂与材料Waters2695/2996高效液相色谱仪，Empower工作站;BP210D型电子分析天平(德国Sartorius公司);高良姜素对照品、山柰素甲醚对照品、DPHA、DPHC对照品均为自制，经UV、NMR、MS确定化合物结构，以HPLC法按面积归一化法计，质量分数98.0%;乙腈(色谱纯);超纯水;高良姜药材为各地收集的市售产品，经广东药学院中药鉴定教研室王凤云老师鉴定均为姜科植物高良姜的根茎。2、方法与结果2.1溶液的制备2.1.1对照品溶液的制备分别精密称取高良姜素、山柰素甲醚、DPHA、DPHB、DPHC对照品，加甲醇制成每1mL含1.068、0.414、1.243、0.248、0.989mg的对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液各1mL，置20mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。2.1.2供试品溶液的制备取不同批号的高良姜药材细粉约0.2g，精密称定，加甲醇约40mL回流提取2h，放冷，过滤，滤液加甲醇定容至50mL。摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。2.2色谱条件广东药学院学报，2008，24(5)第5期陈平,等.高良姜药材中4种有效成分的含量测定色谱柱：DiamonsilTMC18色谱柱(200mm×4.6mm，5μm);流动相：乙腈(A)磷酸水(B)，梯度洗脱[0～30min，A∶42);30～35min，AB(45∶55)]，检测波长：220nm;流速：1.0mL/min;柱温：30℃，进样量：20μL。2.3系统适应性试验分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL注入液相色谱仪，计算理论板数及分离度，结果见表1、图1、图2。2.4线性关系的考察分别精密吸取对照品溶液5、10、15、20、25μL注入液相色谱仪，按“2.2”色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，结果见表1。表1系统适应性试验结果成分线性方程r线性范围/μg高良姜素Y=4.0×106X+5.1×1040.99980.2670～1.3280山柰素甲醚Y=4.0×106X+2.5×1040.99990.1034～0.5170DPHAY=2.0×106X+2.0×1040.99990.3108～1.5540DPHCY=8.2×105X+4.7×1030.99940.2473～1.23602.5重复性试验取高良姜药材细粉(批号20080315)约0.2g，精密称定，共6份，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液后，按“2.2”色谱条件下测定各组分的含量，结果高良姜素、山柰素甲醚、DPHA、DPHC的RSD值(n=6)分别为0.92%、1.60%、0.45%、1.8%，表明方法重现性良好。2.6稳定性试验取供试品溶液(批号20080315)1份，分别间隔4、12、24、36、48h进样，连续测定2d，计算含量，结果高良姜素、山柰素甲醚、DPHA、DPHC的RSD值(n=6)分别为0.71%、1.51%、1.7%、1.9%，表明供试品溶液在48h内测定结果稳定。2.7加样回收率试验取高良姜药材粉末(批号20080315)约0.1g，共6份，精密称定，置100mL锥形瓶中，精密加入“2.1.1”项下的高良姜素、山柰素甲醚、DPHA、DPHC对照品储备液溶液各1mL，按“2.1.2”项下方法制备溶液，按“2.2”项色谱条件操作并计算，结果见表3。表3回收率试验结果2.8样品测定对11批样品按上述方法进行含量测定，以外标法计算高良姜中各成分的含量。结果见表4。表4样品中的4种成分的含量3、讨论3.1提取方法的选择比较了超声提取法、索氏提取法和回流提取法对药材中各成分的提取效果，并对不同的提取条件进行优化，结果发现回流提取法对两类成分的提取效果最好，操作简单，因此选用回流提取法提取高良姜药材制备供试品溶液。3.2测定波长的选择PAD检测器全波长扫描发现，DPHA在220nm和285nm均有较大吸收峰，但是DPHC仅在220nm处有最大吸收峰，高良姜素和山柰素甲醚在267nm和360nm处有较大吸收峰，在220nm处也有末端吸收。所以选择220nm作为测定波长，在无PAD检测器的条件下也可以应用该法，便于推广。3.3色谱柱和流动相的选择比较了DiomonsilTMC18柱、WatersTMC18柱和XterrexTMC18柱3种色谱柱的保留行为，发现WatersTMC18柱保留时间过长，XterrexTMC18柱对黄酮类物质存在严重的拖尾现象，而DiomonsilTMC18柱适用范围广，分离效果好，保留时间相对较短，所以选择DiomonsilTMC18柱。同时考察了甲醇水、乙腈水、乙腈磷酸溶液、甲醇磷酸溶液体系等，最终选用0.2%磷酸溶液乙腈体系进行梯度洗脱，取得较好峰形和较高的理论塔板数，效果满意。3.4指标成分的确定7羟基甲基苯基)苯庚基烯酮(DPHB)是高良姜中二苯基庚烷类物质中的一种成分，药理作用与DPHA和DPHC的药理作用相似，但因其含量较低，不作为考察指标，所以未进行该成分的方法学考察和药材中的含量测定。【参考文献】[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部[S].北京：化学工业出版社，2005:212.[2]BLONSKAM.Effectsofethanolextractofpropolis(EEP)anditsflavonesoninduciblegeneexpressioninJ774A.1macrophages[J].Ethnopharmacol,2004,91:25-30.[3]BOSIOK.InvitroactivityofpropolisagainstStreptococcuspyogenes[J].LettApplMicrobiol,2000,31:174-177.[4]吕玮,蒋伶活.高良姜的化学成分及药理作用[J].药学专论，2006,15(3):19-20.[5]陈佃,何瑞，李彩君.高良姜镇痛止呕有效成分的研究[J].广州中医药大学学报,2001,18(3):240-242.[6]周漩,梁汉明，冯毅凡.高良姜薄层色谱特定(指纹)图谱的研究[J].药物分析杂志，2005，25(8)：916-919.[7]李彩君,陈佃，何瑞.高良姜中二苯基庚烷类化合物研究进展[J].时珍国医国药，2000,11(4):367-368.