麦清蛋白的初步提取

实验四预习报告：麦清蛋白的初步提取1.研究背景生物大分子的分离纯化是科学研究和商业化开发所需要的。而对某一特定目标物的制备是基于其自身独特的性质。但随着纯度要求的提高，同一类物质之间的性质的相似使进一步的精分离难度也随之提高。理论研究对物质浓度的要求，在原有技术难以达到的情况下，必然催生新的技术以提高纯化水平。由此产生了许多的分离纯化技术。在所有的分离纯化技术中，层析技术以其独特的优势始终占据着生物大分子纯化的主导地位。层析法是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以固定相对流动相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。层析法具有明显的优势：（1）从理论上来讲，只要迁移距离足够长，任何物质都可以从其所在的混合体系中被分离出来；（2）除了定性能力较差以外，层析法几乎囊括了物质分析纯化中的所有优点，比如分离效率高、速度快，样品用量少、检测灵敏度高、分析速度快、易于自动化管理等；（3）基于不同的原理，层析法衍生出诸多的操作技术，在实际应用中可以根据待分离物质的特定性质选择适合的操作技术。基于以上原因，层析法在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用，在分离高纯度、高活性的生物大分子中有着不可替代的作用。2.研究目标以凝胶过滤层析法完成麦清蛋白的脱盐以验证该技术的可行性；掌握柱层析技术的基本操作技巧；体会相关技术的发明思路和历程，领悟新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用。3.研究策略本实验选取广泛用于生物大分子纯化的分子筛层析技术完成麦清蛋白的除盐从而来研究层析技术。通过盐析法对小麦种子提取液做初步的提纯，得到麦清蛋白与硫酸铵的混合物，然后通过凝胶过滤层析除盐，最后利用紫外分光光度法测定各阶段纯化产物的OD280以检测蛋白含量，同时用BaCl2检测纯化产物中有无硫酸根离子从而鉴定纯化效果。4.研究方案及可行性分析利用盐析沉淀法获得麦清蛋白和硫酸铵混合液，盐析原理：由于大量中性盐的加入使水的活度降低，不仅原来溶液中的大部分水用于水化盐离子，而且蛋白质表面的水化层也被破坏，使蛋白质分子表面的疏水残基充分暴露，从而发生聚集而沉淀下来[1]。利用凝胶过滤层析除盐。凝胶是一类多孔性高分子不带表面电荷的聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，不能进入凝胶孔内，在凝胶间几乎是垂直的向下运动，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，洗脱时要逐层扩散阻滞，阻滞作用大流程长，移动速率慢因而最后流出层析柱；中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，由于分子量大小不同的物质被洗脱的时间是一定的，经过层析柱后，各物质按其分子量大小不同而被分离。麦清蛋白在280nm处有特异吸收峰，利用紫外分光光度法测定其含量。Ba2+和SO42+会发生反应形成BaSO4白色沉淀，用来检测纯化产物中有无硫酸根离子从而检测本次实验纯化效果。5.具体实验设计5.1所需的主要材料、试剂、仪器实验材料：新鲜小麦种子、葡聚糖凝胶G-25；实验试剂：饱和（NH4）2SO4溶液、1%的BaCl2溶液、洗脱液、蒸馏水；实验仪器：离心机、托盘天平、紫外分光光度计、层析柱、恒流泵、部分收集器。5.2具体操作步骤（1）溶胀凝胶（教师完成）称取适量葡聚糖凝胶G-25→加入足量蒸馏水或洗脱液→沸水浴溶胀5h→搅拌使其悬浮→静置，使大部分凝胶沉降→用倾斜法除去含细碎颗粒的上层液→反复多次，直至无细颗粒为止→将凝胶在真空干燥器中减压除气，准备装柱（2）装柱层析柱下端止水→装入约1/4柱长的洗脱液→倒入凝胶，开启洗脱→装柱至3/4左右，注意使柱中凝胶一直处在溶液中（注：装柱完成后层析柱下端需适时止水以保证洗脱液面高于凝胶页面3～5cm，以防凝胶因脱水而毁柱）→凝胶沉降完成，旋上柱帽并连接洗脱系统，平衡洗脱3h（注：装柱时应保证层析柱的均一性，否则会严重影响分离的结果。合格的凝胶柱应该上下均一，无界面、气泡和裂隙）→连接恒流泵和收集检测系统，调节好流速和收集系统以备下用（控制流速为每滴10秒，收集量为每管3毫升）（3）盐析法分离提取麦清蛋白粉碎2g小麦种子→置于三角瓶中，加20ml蒸馏水→连续震荡0.5h，再间歇震荡0.5h→3000r/min离心20min，取上清液（澄清透明，否则再过滤）→用醋酸调pH至4.7→边搅拌边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，有白色絮状沉淀产生，冰箱冷藏室过夜（充分沉淀麦清蛋白）→3000r/min离心20min，弃上清液，加2ml去离子水充分溶解沉淀，得混合液，准备上样脱盐。（4）上样在柱内放入滤纸片，自然飘落覆盖（防止上样时不溶物侵入柱床和液滴对床面的冲击）→用恒流泵加速按钮使洗脱液面和胶床表面相齐，停止洗脱→将1ml样品提取液注入凝胶床面中央，开启洗脱和收集器收集→待样液与凝胶床面相齐时用滴管加入略高于刚才上样高度的洗脱液，重复两次，（将残留在壁上的样品洗入胶柱，尽量避免样品的稀释以保证充分的分离效果）→用滴管加入3～5厘米高的洗脱液层→戴上柱帽，连续洗脱收集（5）洗脱、收集和鉴定每3ml收集一管→测OD260→以管号为横坐标，消光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，确定蛋白峰值管（保留蛋白峰值管，后续SDS-PAGE实验测定其分子量并检测纯化效果）→分别向各管加入两滴1%的BaCl2溶液（注：蛋白峰值管中不要加入BaCl2），比浊法比较脱盐效果。（6）原始数据记录处管号123456OD280沉淀管号789101112OD280沉淀管号131415161718OD280沉淀5.3实验预计所需时间根据各步操作所需时间，总计大概需要9h。两个人相互协作，互相配合，互相监督，共同完成实验。思考题：1.生物大分子有哪些可利用的性质来完成其自身的纯化？⑴利用溶解度差异，如等电沉淀、盐溶与盐析、有机溶剂沉淀、变性沉淀等；⑵利用分子大小与空间结构差异，如透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤层析等；⑶利用电荷不同性质，如电泳、离子交换柱层析；⑷利用吸附特性，如吸附层析；⑸利用特异性亲和力，如亲和层析。⑹变性与复性等2.以至少两种纯化生物大分子的层析技术为例，探讨它的发明思路。⑴亲和层析：当目标物与杂质的性质非常相似时，一些分离纯化分离无法实现分离。需要借助另外的物质实现分离，自然想到利用某些生物大分子间的专一可逆特异性结合的特点，如酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体、外源凝集素与多糖类、核蛋白与核酸等之间均存在专一的相互作用。此时色谱法的在生物大分子的分离纯化中广泛应用，于是将这两个方面结合。将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析，是利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术[2]。亲和层析快速、高效，用较少的步骤得到高纯度的目标蛋白，于是得到广泛应用。⑵凝胶过滤层析：在蛋白质的粗分级中常用的分离手段是中性盐沉淀以及等电点沉淀，而两种方法所面临的一个问题就是如何除去粗分离后蛋白质中残留的无机小分子。透析法的出现基本上解决了这个问题，但是操作十分繁琐，不仅需要多次更换大量的透析液，同时不断的搅拌经常会破坏蛋白质空间结构，且最终小分子杂质的去除并不彻底；随后人们对透析法稍作改进便发明了超滤法，使得操作过程简便了许多，该法通过加压、离心等处理方式，使水分子穿过半透膜快速离开而大分子蛋白质被截留浓缩，在此过程中同样会产生较强的机械力，蛋白质结构的破坏在所难免，最终其活性回收率并不高。因此，人们迫切需要一种简便、快速且蛋白质活性回收率高的除盐手段。就在这时，尺寸排阻效应的理论基础已经建立，且蛋白质等生物大分子与无机小分子具有显著的大小差异，凝胶过滤层析法在这种情况下产生。随后，在该技术的应用过程中，人们也用它来分离相对分子质量相差较大的生物大分子、溶液浓缩及分子量测定等。3.试着探讨一下一项新技术发明的思维及实施过程。新技术的出现是为了解决实际过程中出现的问题。一项新技术的发明思维及实施过程：明确问题矛盾所在→分析问题，提出方案，利用相关的理论知识对现有的技术进行改造或进行再创造→新技术发明后，要对其进行检验，是否解决了问题以及是否具有稳定性和可重复性→检验可行后，可进行推广并申请专利→在实际使用过程中有可能还会暴露一些问题，再进行调整和改进（应用到工业生产中更要多方面考虑）。4.中性盐沉淀中硫铵分级沉淀是蛋白质粗分级中最常用的手段，为什么？中性盐沉淀的原理是大量中性盐加入使水活度降低，它们在争夺溶剂水的同时破坏蛋白质表面的水化层，使疏水氨基酸暴露，从而发生聚集沉淀下来。不同蛋白质分子表面的疏水氨基酸含量不同，溶解度也存在差异，因而沉淀所需中性盐浓度也不一致，蛋白质溶解度越高，沉淀所用的盐浓度越高。因此使用特定浓度的中性盐可使目标蛋白从混合体系中得到初级分离。硫酸铵分级沉淀之所以被常用于蛋白质的粗分级，原因是：⑴硫酸铵化学性质稳定，可以去除杂质，但不破坏蛋白质的空间结构；⑵硫酸铵为二价离子，等浓度时离子强度高，能更有效的降低蛋白质溶解度；⑶硫酸铵在水中的溶解度大、温度系数小，在低温时仍可以高浓度存在，不仅能有效争夺溶液中的水以及蛋白质水化水，还满足了低温下沉淀蛋白质的需要，使蛋白质在保持活性的情况下，很容易分离出来；⑷通过改变盐浓度，可以实现分级分离。5.本次实验中，洗脱液应该是什么？选择的依据是什么？选择洗脱液依据：⑴洗脱液应该具有一定的pH且原则上应远离目标蛋白的等电点，避免蛋白质沉淀堵塞层析柱，影响分离效果；⑵对于分子量较大的物质，溶液的粘度随浓度（一般不超过4%）增加而增大，会使分子运动受限，故洗脱液与样品的相对粘度不得超过1.5-2；⑶洗脱液应与溶胀剂一致，否则改换溶剂会使凝胶体积产生改变，影响分离效果；⑷要考虑填料对分离物的吸附作用，本实验填料为交联葡聚糖凝胶，它为弱酸性物质，含有羧基基团，能与分离物中的带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用，而这种吸附作用则可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服（通常加入NaCl）。基于以上考虑，洗脱液需要有一定的离子强度和pH，通常选取单一缓冲溶液或其盐溶液，有时甚至可用蒸馏水。针对本实验而言，麦清蛋白等电点为4.5～4.7，交联葡聚糖在强酸性条件下又会发生水解而使其结构发生破坏，故洗脱液常用0.02～0.1mol/LpH6.9～8.0的PBS液（0.14mol/LNaCl）或0.1mol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14mol/LNaCl）。