鼠青光眼模型构建方法研究进展

鼠青光眼模型构建方法研究进展泰山医学院附属医院眼科王艺综述北京大学第三医院眼科吴玲玲审校【摘要】青光眼是世界第二大致盲眼病。以病理性眼压升高为其首要特点和发生,发展的重要因素。本文就青光眼鼠模型的发展历程和不同类型模型的特点、诱导方法及结果进行分析，并对其眼压测量方法做一汇总。本文就这领域的研究进展作一综述。【关键词】青光眼；眼压；鼠；动物模型ResearchofconstructionmethodinratmodelofexperimentalglaucomaWangYi,DepartmentofOpthalmology,AffiliatedHospitalofTaishanMedicalCollege，Taian,271000,China.WUling-ling,,PekingUniversityThirdHospitalEyecenter,Beijing,100191,ChinaCorrespondingauthor：WangYi,Email：[e-mail]【Abstract】Glaucomaisthesecondgeneralblindnessdisease.Thepathologicalfeaturesofintraocularpressureanditsfirstoccurrenceanddevelopmentofimportantfactors.Inthispaper,thedevelopmentofmousemodelsofglaucomahistoryandcharacteristicsofdifferenttypesofmodels,methodsandresultswereanalyzedinduction,anditsintraocularpressuremeasurementmethodstomakeasummary.Inthispaper,theseareasofresearcharereviewed.【Keywords】glaucoma;intraocularpressure;rat;animalmodels一、概述青光眼是一类由于病理性眼压升高以及多种神经、体液因素引起进行性视神经损害,致视乳头进行性凹陷性萎缩伴视功能、特别是视野损害的眼病。最典型和最突出的表现是视神经萎缩和视野的缩小、缺损,如不及时采取有效的治疗,视野可以全部丧失,终至失明。流行病学资料表明,青光眼现为世界第二大不可逆性致盲眼病[1,2],我国原发性青光眼患病率为0.21%-1.64%[3]。目前认为，青光眼的病理基础是视网膜节细胞(retinalganglioncells,RGCs)的不断丢失及其轴突数目的不断减少[4]，这种丢失以细胞凋亡的方式进行，而RGCs层内神经营养因子的减少、视网膜和玻璃体内谷氨酸浓度升高、RGCs内Ca2+超载、NO和自由基的增加，这些都直接或间接参与了RGCs的凋亡过程[5，6]。传统青光眼的治疗主要通过手术和药物,降低眼压以达到保护视神经的作用,但部分病人眼压正常后视神经的损伤仍然进展[7]。近年来,青光眼视神经保护的方法[8]大体可分为:(1)外源性补给神经营养因子:脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophinfactor,BDNF)、睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)、胶质源性营养因子(glialcellderivedneurotrophicfactor,GDNF)等;(2)避免毒性物质损害:抗氧化剂、自由基清除剂和一氧化氮合酶抑制剂等;(3)干扰凋亡途径:抑制凋亡蛋白酶、抑制内核酶和促进bcl-2过度表达等;(4)与受体相互作用:NMDA受体拮抗剂、β受体阻滞剂和α2-肾上腺素能受体激动剂等;(5)其他:抑制蛋白合成、抑制单胺氧化酶和减少钙内流等。随着对青光眼发病机制和治疗方法探索的进一步深入，如何建立合适而准确的青光眼动物模型成为广大科研工作者亟需解决的首要问题之一。啮齿类动物的眼睛与人眼解剖结构的相似,如小梁、Schlemm管、睫状体、视网膜血管等[9]另外，鼠类容易用转基因技术改造和繁殖,花费较少,因此，鼠青光眼模型逐渐得到更多的应用[10]。本文就鼠青光眼模型的应用的发展和现状作一综述。二、鼠青光眼模型的分类及其构建方法发展探究鼠青光眼模型主要分为两大类：非高眼压青光眼模型和高眼压青光眼模型，其中前者被用来研究某些特殊类型青光眼，而后者被用来观察与眼压升高相关的病理变化。1非高眼压青光眼鼠模型1.1玻璃体腔内注射兴奋性氨基酸DreyerEB[11]等研究发现在玻璃体腔内注射兴奋性氨基酸谷氨酸或N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA),可以在不影响眼压的情况下引起视网膜细胞的死亡,这种方法被用来制作研究兴奋性氨基酸在青光眼中的作用的动物模型。谷氨酸和NMDA均会引起视网膜神经节细胞(retinalganglialcel,lRGCs)死亡,大鼠玻璃体腔注射谷氨酸或NMDA20~200nmol后1h就会出现细胞固缩[12],注射后第6d可见RGCs死亡[13],而小鼠的眼球较小,剂量可减少到2~10nmol。相对于单次快速注射,多次低浓度玻璃体腔内注射兴奋性氨基酸也可以产生相似的视网膜损伤。Vorwerk等[14]的研究证明,每隔5d注射2.5nmol的兴奋性氨基酸持续3个月后,随着视网膜的兴奋性氨基酸水平逐渐提高,RGCs逐渐凋亡，细胞数量可减少42%。Siliprandi等[15]发现NMDA会导致剂量依赖性胆碱乙酰基转移酶的缺乏,说明神经细胞的功能受损。同时观察到Thy-1mRNA(一种RGCs的特异标志物)在损伤视网膜的表达显著减少[16],进一步验证了注射NMDA除可以损伤RGCs外,同时会导致视网膜内核层细胞的凋亡。用玻璃体腔内注射兴奋性氨基酸的方法建立的青光眼模型,建模时间短、可重复性强,其缺点为，模型建立在氨基酸毒性单一机制基础上,而此机制目前国际上尚有争议。1.2视神经损害雷季良等[17]在显微镜或解剖镜下通过眶内部眼球后1~5mm处离断视神经,建立视神经损伤动物模型,这种方法损伤了视神经的所有轴突,从而导致时间依赖性的RGCs死亡,在手术后1周约50%的RGCs死亡,而术后2周所有的RGCs会消失,失去视觉功能。大鼠视神经离断后4个月,视网膜电图(electroretinogram,ERG)完全消失[18，19]。此法属完全性视神经损伤,可以模拟青光眼视神经损伤的病理学变化,但不会影响到视网膜动脉和静脉,因此不会影响视网膜的血供。简单易行,容易保证实验动物致伤量的一致性。Yoles等[20]的研究表明,视神经损伤也可以用外力挤压视神经的方法获得,这种方法可以对视神经产生不同程度的损伤,较视神经离断更加接近青光眼的病程,常被用来研究RGCs的变性病理过程及筛选视神经保护的药物。但目前尚无统一的方法来标准化操作过程,如何提高模型的可重复性有待解决。1.3内皮素诱导视神经损伤1995年，SugiyamaT[21]等研究证明,在血压正常的原发性开角型青光眼患者,尤其是进行性视野缺损的患者（什么部位或体液？）内皮素-1的水平明显高于正常同龄人,玻璃体内或视神经周围注射内皮素-1可以导致视网膜局部缺血。家兔和非人灵长类动物眶内注射内皮素-1导致视网膜局部缺血的模型已有报道。2004年，Chauhan等[22]对模型进行改良并用于大鼠,内皮素-1经由渗透泵注入球后,RGCs会呈时间依赖性凋亡。内皮素-1引起视神经损伤的机制尚未完全阐明。2高眼压青光眼鼠模型2.1自发性高眼压DBA/2J和AKXD-28/Ty的纯系小鼠年老时会自发性眼压升高并产生类似于人类青光眼的视网膜疾病，适于进行青光眼机制和干预的研究。DBA/2J小鼠在7~8个月龄时发生自发性高眼压，表现为虹膜萎缩,色素播散,虹膜前粘连,眼压升高,形成了进行性继发性闭角型青光眼模型,类似于人的色素播散综合征和角膜虹膜内皮综合征[23]。长期高眼压可引起DBA/2J小鼠RGCs凋亡,同时伴视盘神经纤维层变薄以及视盘变大。同一小鼠的两只眼以及同龄的不同小鼠的眼压变化并不相同,随着房水生成系统的退化,DBA/2J小鼠的眼压会在其10~12个月龄时有所下降。两种纯系小鼠模型的主要不同点在于AKXD-28/Ty小鼠不发生色素播散,只有虹膜基质的萎缩,同时其RGCs和视神经对高眼压更敏感[24，25]。2.2光照法一种较温和的引起眼压升高的方法是使动物24h暴露于光照的环境中,影响了动物的昼夜节律从而刺激房水分泌[26]。这种低的光照强度并不会引起视网膜光毒性,并且缓慢升高的眼压更接近青光眼患者的眼压变化。与临床上青光眼患者类似,但需要相当长的造模时间才能引起视网膜的变化[27]因此,这种模型对于青光眼视网膜病变的研究具有很大的局限性。多用来研究疾病相关因子,结合其他引起眼压升高的方法研究眼压升高与视网膜病变的关系。1994年，Mermoud等[28]在48只大鼠的前房内注射S2抗原,用Tono2Pen22眼压计测量眼压。平均眼压:注射前为(2015±514)mmHg,注射后2～5天下降到(1615±413)mmHg,在6～20天上升到(3518±911)mmHg。注射后9～21天,组织病理学检查发现:眼前节和后节都有炎症反应。用FITC2白蛋白稀释技术测量房水生成和用前房压力灌注法测量房水流畅系数。注射S2抗原后3天房水生成下降,而房水流畅系数增加,7和14天房水生成增加,而房水流畅系数正常或下降。该模型有三个特点:(1)眼压升高;(2)高眼压合并有临床和组织学上的炎症反应;(3)有色素膜炎后遗症,眼压不稳定。该研究作者认为:这种模型可用于研究合并有色素膜炎的眼压变化机制。翌年,Mermoud等[29]为了研究注射S2抗原后2和6天眼压下降的原因,测量房水中前列腺素E2和F2α的水平。发现早期眼压下降的原因是房水中前列腺素F2α增加的结果。2.3巩膜上静脉注射高渗生理盐水1997年，Morrison等[30]在大鼠的上巩膜静脉内注射高渗盐水,使房水排出道产生瘢痕,诱发高眼压。他们用一特制的C型塑料环暴露大鼠1条巩膜上静脉,同时压迫大多数巩膜上静脉,将50μL高渗盐水注入暴露静脉,由于大多数巩膜上静脉被压迫,注入的高渗盐水多流入巩膜静脉窦以及前房,炎症以及瘢痕的形成使这些组织硬化,该实验中9只眼注射1次后眼压升高,7只眼多次注射后眼压升高,1只眼注射后形成低眼压，眼压平均升高7～28mmHg，程度与大鼠个体对于高渗盐水反应的差异有关,对于部分大鼠二次注射是必需的。这种方法引起的高眼压是可以保持的,有报道可以延长至200d。组织学检查发现:在高眼压影响下,视神经轴突受损,涉及横断面神经区的100%。眼压不太高或持续时间较短,神经区的受损范围为0.5%～10.4%。受损神经70%,集中在颞上侧。1998年，Morrison等[31]在16只成年大鼠的一只眼的上巩膜静脉内注射高渗盐水。然后双眼每日点下列药物2次:人工泪液(n=6);015%倍他洛尔(betaxolol)(n=5);0.5%氨可乐定(apraclonidine)(n=5)。在动物清醒情况下,持续测量眼压17日,然后取材观察。平均眼压:人工泪液治疗组,试验眼为(39±2)mmHg,对照眼为(29±1)mmHg,两者差别明显;倍他洛尔和氨可乐定治疗组,试验眼的眼压分别为(29±7)mmHg和(29±4)mmHg,对照眼均为(28±1)mmHg,两者无明显区别。就所有试验眼来说,倍他洛尔和氨可乐定治疗眼的平均眼压明显低于人工泪液治疗眼。对试验眼视神经的定量组织学检查发现:在人工泪液治疗的6只眼中有4只眼视神经受损达100%;而在两种抗青光眼药物治疗的10只眼中只有3只眼的视神经受损。结论:对于鼠青光眼鼠模型,抗青光眼药物降低眼压有助于防止视神经受损。2000年，Jia等[32]在17只大鼠的一条上巩膜静脉内注入高渗盐水,使眼压升高。然后分别在白昼和夜间测量眼压,持续34天。发现夜间眼压