青霉素高产青霉菌的工艺研究

青霉菌高产青霉素的工艺研究PenicilliumTechnologyResearchofHighYieldofPenicillin13生工杨雅娴1308301001目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。高产青霉素的菌种需经菌种的选育，青霉素的生产包括发酵和提取两部分。工艺流程大致如下：菌种的保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。WorldwidefortheproductionofpenicillinproducingstrainweremostlyproducedforPenicilliumchrysogenumstrains,obtainedthroughdifferentwaysofimprovement.High-yieldbreedingofpenicillinsubjecttostrainsofbacteria,penicillinproductionincludingfermentationandextractionintwoparts.Processflowisasfollows:thepreservationofspecies,sporepreparation,seedpreparation,fermentation,extraction,andrefining.关键词：青霉素、高产、选育方法、工艺一青霉素菌种选育方法抗生素产生菌的菌种选育工作是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌株，从而促进生产发展。所谓菌种选育，就是利用菌种遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状，经筛选获得新的适合生产的突变株，提供生产，以稳定提高抗生素产量或得到新的抗生素产品。提高抗生素产生菌的抗生素产量是菌种选育技术的最基本的任务。抗生素是微生物生物合成的产物，由于微生物新陈代谢的特殊性，抗生素发酵生产的原料与抗生素产量并不像化学合成一样有严格的计量关系，采用具有高产优质代谢特性的菌株作为生产菌株，可以在不增加或少增加原料、设备的情况下，大大提高抗生素产量，增加经济效益。菌种选育技术随着分子生物学、分子遗传学的发展也在不断提高，不断丰富着新的内容。育种技术有自然育种、诱变育种和杂交育种等，随着抗生素合成途径的阐明，菌种选育由诱变结合随机筛选发展成理性筛选，大大提高了筛选频率。1.1自然选育菌种选育最早是利用菌种的自发突变来自然选育，应用菌种自发突变，提高了抗生素生产水平。自然选育是一种纯种选育方法，它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选，排除衰退型菌株。以此来达到纯化菌种、复壮菌种、稳定生产的目的。自发突变是指在没有人工干预下生物体自然发生的突变。微生物以10-6左右的突变率进行自发突变。生产上将该方法又称为自然分离。在制药企业，一般情况下生产上采用的选育方法为自然选育方法，利用每年的春季、秋季进行菌种的自然分离，从中挑选高产稳定菌株，制备砂土管或深冷管保藏。自然选育的方法经济实用，技术难点低；缺点是正突变率太低，难以大幅提高生产水平。1.2紫外诱变选育紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复合酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株。用15W或20W紫外灯管，距离15cm～30cm，照射l0sec—20min。在照射受试菌前，灯管须预热20min，使灯光稳定。菌悬液要磁力搅拌，使所有单细胞或单孢子均匀受到照射。紫外线诱变由于使用方便、效果显著，所以一直以来受到人们的青睐。紫外线诱变操作简单，工厂实验室一般可自制紫外线照射箱来进行紫外线照射处理。1.3抗生素诱变选育诱变育种是抗生素发酵中常用的主要育种方法。它利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株。诱变育种应用其单核的孢子。用稀释的表面活性剂制备单孢子悬液，常用的表面活性剂是吐温-80(Tween-80)，浓度0.01％～0.1％。选用最适剂量在高诱变率的前提下，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，即为最适剂量。利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂的同时使用，均常呈现一定的协同效应，会取得更好的诱变效果。利用微生物形态、生理与产量间的相关指标，如变色圈、水解圈、抑菌圈、反应圈的大小等，以便在初筛中即可从形态性状估计其生产潜力。设计和采用高效筛选方案和方法，以期花费最少的工作量，在最短的时间内，取得最大的成效。诱变育种和其他育种方法相比较，具有速度快、收效大、法简便的优点，缺点是诱发突变缺乏定向性，必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。1.4次级代谢产物高产菌株的筛选方法1.4.1筛选负突变的回复菌株选择经过诱变处理后抗生素生产能力明显降低或者完全丧失、但其它性状仍近于正常突变株作为实验材料，进行诱变，再挑选高产菌株。因为二次诱变都作用于和抗生素生物合成有关的基因上，动摇了抗生素合成的遗传基础。用此方法得到的突变株，其抗生素合成的酶受到调节的程度，往往低于原出发菌株。此外，从负突变株中筛选回复突变株较容易，因为负突变株产量较低或者没有产量，便于从中检出有较高产量的回复突变株。1.4.2筛选去碳源分解代谢调节突变株速效碳源被快速分解利用时，往往对其他代谢途径中的酶（包括许多抗生素合成酶和其他的酶）有阻遏或抑制作用，成为青霉素发酵产量的限制因素，不利于发酵生产的工艺控制。筛选去碳源分解代谢调节突变株，对于提高青霉素发酵产量具有重要意义。青霉素生产中最常见的碳源分解代谢调节是“葡萄糖效应”，葡萄糖被快速分解代谢所积累的分解代谢产物在抑制青霉素合成的同时也抑制其他某些碳、氮源的分解利用。因此，可以利用这一性质进行抗葡萄糖分解代谢调节突变株的筛选。筛选去碳源分解代谢调节突变株要注意避免走另一个极端，即片面追求葡萄糖分解代谢速率下降，因为保持合适的葡萄糖分解代谢速率是发酵高产的关键。1.4.3筛选前体或前体结构类似物抗性突变株前体或前体结构类似物对于某些菌的生长有抑制作用，且可抑制或促进抗生素的合成。筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株可消除其对产生菌的生长及其抗生素的抑制作用，高产量。第一类前体是产生菌不能合成或很少合成的化合物，需要人为加入发酵培养基以促进产抗。第二类前体是产生菌能够合成但不能大量积累的初级代谢产物，发酵生产中需要补以促进产抗。第三类前体是初级代谢终产物，对本身的生物合成有反馈调节作用，难以大量积累。1.4.4其他生物育种技术现代基因工程的研究成果，使基因克隆技术进入青霉素产生菌育种领域，持续的菌株改良，结合发酵工艺的改进，使当今世界青霉素工业发展水平突飞猛进。二青霉素的生产流程2.1菌种的保藏从来源于自然界土壤等，获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育和纯化后即称为菌种。菌种可用冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱（-190~-196℃）内保存。所谓冷冻干燥是用脱脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，经真空冷冻、升华干燥后，在真空下保存。如条件不足时，则沿用砂土管在0℃冰箱内保存的老方法，但如需长期保存时不宜用此法。一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。2.2孢子的制备生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5~7日或7日以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的。为获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基（如小米、大米、玉米粒或麸皮）上扩大培养。2.3种子制备其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐级扩大培养。或直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后以无菌操作接入孢子，放在摇床上恒温培养。在种子罐中培养时，在接种前有关设备和培养基都必须经过灭菌。接种材料为孢子悬浮液或来自摇瓶的菌丝，以微孔差压法或打开接种口在火焰保护下按种。接种量视需要而定。如用菌丝，接种量一般相当于0.1%~2%，从一级种子罐接入二级种子罐接种量一般为5%~20%，培养温度一般在25~30℃。如菌种系细菌，则在32~37℃培养。在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌空气。控制罐温、罐压，并定时取样作无菌试验，观察菌丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析等，并观察无杂菌情况。种子质量如合格方可移种到发酵罐中。2.4青霉素发酵工艺控制青霉素大规模生产是采用三级发酵，其目的主要是使青霉菌军体数量逐步扩大和适应发酵，其次是使发酵罐连续使用，缩短发酵周期。2.4.1碳源、氮源的影响和控制。2.4.1.1碳源青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄搪、甘露糖、淀粉以及天然油脂等。葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长；乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素发酵培养基中采用葡萄糖和乳糖两种碳源就能适合青霉菌发酵过程中的生理变化、在发酵初期利用氧化速率快的葡萄糖使青霉素大量、迅速、强壮地繁殖菌丝体；当葡萄糖耗尽时青霉菌进入发酵后期，此时利用氧化缓慢的乳糖，使发酵液pH较稳定，避免速效碳源的分解产物阻遏作用，有利于青霉菌大量、持久地分泌青霉素。2.4.1.2氮源玉米浆是青霉素发酵最好的氮源，因为玉米浆含有多种氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸以及青霉素生物合成的前体苯乙酸及其衍生物。由于玉米浆的质量难以控制，也可选用便于保藏和质量稳定的花生饼粉或棉籽饼粉来代替。2.4.2影响发酵产率的因素基质浓度在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制，而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成，为了避免这一现象，在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加，因为即使是超出最适浓度范围较小的波动，都将引起严重的阻遏或限制，使生物合成速度减慢或停止。2.4.3pH值青霉素发酵的最适pH值一般认为在6.5左右，有时也可以略高或略低一些，但应尽量避免pH值超过7.0，因为青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中，pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。2.4.4温度的影响及控制青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜温度是20℃左右，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。如采用从26℃逐渐降至22℃的发酵温度，可延缓菌丝衰老，增加培养液的溶解氧浓度，延长发酵周期，有利于发酵后期青霉素单位的增长，减少发酵液中青霉素的降解破坏，提高产量。2.4.5消沫发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。少量多次。不适在前期多加入，影响呼吸代谢。2.5青霉素的提炼工艺过程2.5.1过滤青霉素发酵液过滤宜采用鼓式真空过滤器，如采用板框压滤机则菌丝常流入下水道而影响废水治理。且劳动强度大，并对环境卫生不利。过滤前加去乳化剂并保温。2.5.2萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。将发酵滤液酸化至PH久后加相当于发酵滤液体积1