韭菜醇浸提物GC-MS分析及其对食品污染菌的抑制作用

韭菜醇浸提物GC/MS分析及对食品污染菌的抑制作用1李洪山张红申玉香宋传喜（江苏盐城工学院，江苏盐城224051）摘要：为了解韭菜浸提物的成分与抑菌作用，采用乙醇对韭菜叶片进行浸提，并利用GC/MS进行成分分析和滤纸片法来测定韭菜粗提取物对食品污染菌的抑菌作用，结果表明浸提物中主要有10种组分，硫醚类含量较高。浸提物抑菌作用的大小与其体积分数有关，100%韭菜浸提物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌都具有抑制作用，其中对大肠杆菌的抑菌作用最强，不同菌株之间的抑菌效果有显著性差异。20%韭菜浸提物对不同菌株的抑菌效果无显著性差异。韭菜浸提物可以作为植物源抑菌物质和果蔬保鲜剂应用。关键词：韭菜醇浸提物GC/MS抑菌作用GC/MSAnalysislandtheInhibitoryActiontotheFoodPollutantBacteriaoftheAlcoholExtractsfromAlliumtuberosumLiHongshanZhangHongShenYuxiangSongChuanxi(YanchengInstituteofTechnology,Yancheng224051)Abstract:InordertothecomponentandinhibitoryactiontothebacteriaofthealcoholextractsfromAlliumtuberosum,theGC/MSandfilterpapermethodwereused.Itwereappearedthatthereweretenelementsinthealcoholextracts,andtheHighcontentwassulfurether.Theeffectiveofinhibitoryactionofthealcoholextractswaswiththerelevantofitsvolumefraction,100percentofithadtheinhibitoryavailabilitytoallbacteriainthetest,andthestrongestinhibitoryactivitywasagainstEscherichiacoli.Thereweresignificantdifferenceamongbacteria.Thewereinsignificantdifference1基金项目：国家级星火科技项目（2013GA690129）；江苏省苏北科技发展计划（BN2014131）；盐城市农业科技项目（YKN2014003）作者简介：李洪山，男，教授，博士，研究方向:有害生物治理及生物资源利用。电话:[phone],E-mail:[e-mail]liumtuberosumcouldbeusedfortheplantderivedantibacterialsubstancesandfruitandvegetablepreservative.Keywords:AlcoholExtractsfromAlliumtuberosum;GC/MS;InhibitoryAction韭菜（Alliumtuberosum），又称起阳草、壮阳草、草钟乳等，原产于亚洲东部和南部，为百合科葱属多年生宿根性辛香类蔬菜。韭菜营养价值很高，含有丰富的蛋白质，脂肪，纤维素、胡萝卜素、Vc以及钙、磷、铁等矿质元素[1]，韭菜还含有多种生物活性物质，如硫化物、甾体皂苷、氮化物、黄酮类等物质，有温中、补虚、益阳、调和脏腑的作用明显[2-4]。韭菜汁液及提取物具有杀虫抑菌作用[5-7]，韭菜乙醇粗提物对储藏期柑橘青霉病菌都有不同程度的抑制作用，且随着浓度的增大抑菌作用增强，随着培养时间的延长抑菌作用降低，以新鲜茎叶对菌丝生长的抑制作用最大，干根次之，干茎叶的抑制作用最小[8]。韭菜提取物还能够延缓香蕉果皮叶绿素的降解，能够降低香蕉呼吸速率、乙烯释放量，有保鲜作用[9]。本实验研究分析了韭菜叶片乙醇浸提物的组成及其对常见食品污染菌的抑制作用，为开发植物源新型抗菌药物及食品防腐剂提供科学依据。1材料与方法1.1材料韭菜（Alliumtuberosum），新鲜叶片，购于盐城市亭湖区菜市场。供试菌株为大肠杆菌(Escherichia.coli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、沙门氏菌(salmonellasp.)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)五种，均受赠于盐城市疾病预防控制中心。1.2试验方法1.2.1韭菜叶片醇浸提物的制备取新鲜韭菜叶片洗净、晾干，然后置于60℃烘箱内烘干时长为12h后、粉碎成粉末备用。将95％的乙醇溶液加水稀释到浓度为70％，将韭菜粉末50g置于500ml的锥形瓶内，按料剂比1:8加入70％的乙醇溶液400ml，然后用保鲜膜密封，浸提12h后抽滤，将滤液收集在锥形瓶内，密封，置于冰箱内保存。将抽滤后所得韭菜粉末再按料剂比1:8加入70％的乙醇溶液进行浸取，总共浸取三次，合并三次浸取液，将合并后的提取液轻轻摇晃，混合均匀，50℃下用旋转蒸发仪进行浓缩至粘稠状。将浓缩后的提取物置于冰箱中密封保存备用。1.2.2菌种的活化、菌悬液和含菌平板的制备用镊子夹着已经灭菌过的牙签从试管斜面上挑取微量供试菌株于配制好的液体培养基内，包扎密封。将包扎好的锥形瓶置于摇床上37℃培养18h。看到菌悬液浑浊即得到供试菌悬液（现配现用）。液体培养基的配方为牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，调节PH7.0-7.2。将融化冷却后的固体培养基约10mL倒入培养皿中冷却凝固，用移液枪吸取稀释好的五种菌悬液150μL加入培养皿中，再用灭菌过的涂布棒轻微均匀的涂布在固体培养基表面制成含菌平板。固体培养基配方为牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水100ml，调节pH7.0-7.2。以上各个步骤均在无菌条件下操作完成。1.2.3韭菜叶片醇浸提物的成分分析实验取1mL粗提取物置于试管内，加入浓度为70％乙醇溶液进行稀释，再加入3g的无水硫酸钠，静置12h后进行GC-MS分析。色谱条件：汽化室温度200℃,载气：99.999％高纯氦；载气流速：1.2ml/min，线速度40cm/s弹性石英毛细柱：AT-SE54（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升温60℃开始，恒温4min，以4℃/min升至290℃，恒温10min。质谱条件：离子源：EI源：离子源温度230℃；四极杆温度150℃；离子源电离能：70eＶ，谱库：美国NIST02L，接口温度:280℃。1.2.4韭菜叶片醇浸提物的体外抑菌试验研究取适量浸提物加入无菌水稀释到体积分数为20％、40％、60％、80％、100％。取6mm直径的圆形滤纸片，分别放入已经稀释好的不同体积分数的韭菜提取液、无菌水、70％乙醇溶液中浸泡24h，用镊子将制备好的滤纸片均匀间隔的贴在含菌平板表面中央，并轻压纸片，使其与培养基接触良好，同时以乙醇和无菌水作为对照，将贴好的平板倒置与37℃恒温培养箱中培养24h，取出，观察抑菌圈大小，用游标卡尺测定并记录结果，试验3次重复。抑菌率(%)=(试验组抑菌圈直径-空白滤纸片直径)/抑菌圈直径×100％1.3数据处理方法用EXCEL和DPS2.0进行数据统计和方差分析。2结果2.1韭菜叶片醇浸提物GC/MS分析结果RT:2.50-19.004681012141618Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance13.1913.1313.2513.415.1614.2711.529.5214.6515.412.789.6816.269.048.7217.3018.177.736.314.317.45NL:2.35E7TICF:MSSCX图1韭菜叶片醇浸提物总离子流图由图1可以看出，一共分离出来了10种物质，将所得化合物根据质谱图经计算机检索和人工解析鉴定，由面积归一化法计算各组分在总样品韭菜浸提物的质量分数。结果见表1。表1韭菜叶片醇浸提物的GC-MS分析结果由表1可以看出，韭菜中含有丰富的硫醚类及酯类化合物，其中硫醚类化合物占了总样品组分的27.39%，为韭菜抑菌作用的主要活性物质，对一些食源性的微生物具有抗菌活性。此外，韭菜中还含有一些酯类化合物，如乙酸丁酯、丁酸乙酯，这两种化合物都具有果香。名称分子量分子式相对含量(%)丁酸乙酯116.16C6H12O23.00乙酸丁酯116.16C6H12O210.97甲基烯丙基二硫醚120.24C4H8S23.30甲基三硫醚126.25C2H6S324.091-甲基-3-对甲苯基三氮137.21C8H11N311.751-[3-（4-溴苯基）-2-硫脲]-B-D-脱氧吡喃葡萄糖2,3,4,6-四乙酸561.38C21H25BrN2O9S0.934-羟基-3-甲基苯乙酮150.16C9H10O227.73丙烯基脱硫硫代葡萄糖苷279.30C10H17NO6S3.631,1-二甲酰基-8-8-二氯-1,3,5,7-四烯231.06C10H8Cl2O212.01邻苯二甲酸，十一烷基酯376.51C23H36O42.592.2同种体积分数的韭菜叶片醇浸提物对不同菌株的抑菌效果本实验选用分别为20%与100%两种体积分数的韭菜粗提物来研究同种韭菜粗提物对不同菌株的抑菌效果。表2体积分数为20%的韭菜叶片醇浸提物对五种菌株的抑菌效果菌种抑菌直径（cm）抑菌率(%)金黄色葡萄球菌0.69±0.023113.81±2.9098大肠杆菌0.71±0.015316.25±1.8015沙门氏菌0.70±0.020814.64±2.5630绿脓杆菌0.72±0.020817.38±2.3389奇异变形杆菌0.73±0.020017.77±2.2553F值2.0432.052F0.01(4,10)=5.99,F0.05(4,10)=3.48由表2可以看出，20%的韭菜叶片醇浸提物的抑菌效果均较差，其中对奇异变形杆菌的抑菌效果相对较高，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最差。按照低浓度的韭菜粗提取物对五种菌的抑菌作用的强弱排序，依次是奇异变形杆菌绿脓杆菌大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌。并且，经F值比较后发现，低浓度的韭菜粗提物对这五种菌的抑菌效果没有显著性差异，即低浓度的韭菜粗提物对五种菌的抑制效果相仿。表3体积分数为100%的韭菜叶片醇浸提物对五种菌株的抑菌效果菌种抑菌直径（cm）抑菌率（%）金黄色葡萄球菌0.95cB±0.030036.80cB±1.9954大肠杆菌1.10aA±0.050045.38aA±2.4857沙门氏菌0.98bcB±0.025238.96bcB±1.5526绿脓杆菌1.00bcAB±0.035140.15bcAB±2.0890奇异变形杆菌1.03bAB±0.020841.54abAB±1.1778F值6.934**6.853**F0.01(4,10)=5.99,F0.05(4,10)=3.48由表3可以看出，100%的韭菜叶片醇浸提物对五种菌株的有一定的抑制效果，其中对大肠杆菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最弱。按照韭菜粗提取物对这五种菌的抑菌作用强弱排序依次是：大肠杆菌奇异变形杆菌绿脓杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌。经F值比较后发现，高体积分数的韭菜粗提取物对五种菌的抑制作用存在极显著性差异。尤其是对大肠杆菌的抑制作用跟对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌的抑制作用有极显著性差异。对金黄色葡萄球菌的抑制作用跟对沙门氏菌、绿脓杆菌的抑制作用无显著性差异，跟奇异变形杆菌有显著性差异。对沙门氏菌、绿脓杆菌、和奇异变形杆菌的抑