植物基因工程

第六章植物基因工程转基因植物将外源基因导入植物细胞，经组织培养，获得能够表达外源基因的植物称为转基因植物。抗虫抗病抗逆生产药物外源基因：选择？克隆？植物细胞：受体细胞的种类？导入：方法？组织培养：（略）表达外源基因：如何检测、筛选？植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是转基因植物生产的关键一、高等植物的遗传特性植物的基本特征:遗传操作的简易性能产生大量的后代整株植物的再生性不能有效地吸收外源DNA；细胞全能性染色体的多倍体性多倍体植物的遗传不稳定性，导致体细胞变异二、高等植物的基因转移系统Ti质粒介导的整合转化程序植物病毒介导的转染程序(略)植物细胞的直接转化程序植物原生质体的再生程序（一）Ti质粒介导的整合转化程序Ti质粒的结构与功能双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）介导的，又称肿瘤诱导质粒。（1）Ti质粒的图谱区整个质粒160-240kbT-DNA区、Vir区、Con区、Ori区①转移DNAT-DNA（transfer-DNA）左边界右边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成tmstmttmrT-DNA12-24kbtms的编码：合成吲哚乙酸tmr的编码：合成植物分裂素tmt的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱在T-DNA的两端还含有左右2个边界，长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。③Con区(regionsencodingconjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。④Ori区(originofreplication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti质粒的自我复制。第一步:植物受伤乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱导Ti质粒的毒性基因表达。第二步感染植物脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位第三步毒性基因（vir）表达第四步T-DNA转移单链T-DNA被切下来，整合到植物基因组中。第五步诱导冠瘿瘤(2).农杆菌的感染和生存T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）能够自发地整合到植物的染色体上。能转化多种植物。强启动子(3).Ti质粒转化的对象(4).Ti质粒作为载体的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。①野生型Ti分子大（200kb）操作起来十分麻烦；②各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶切位点很少；③tms和tmr基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；⑤无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。(5)天然Ti质粒作载体的缺点（6）、Ti质粒的改造除去T-DNA上的tmt，tms和tmr生物合成基因；除去Ti质粒的其它非必需序列，安装大肠杆菌复制子，安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。改造后的Ti质粒载体模式ori(7)Ti载体的类型共整合载体（cointegratevectors）由比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。双元载体（binaryvectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。①pGV3850特点：外源基因不能直接插入，需要借助于pBR322质粒作为中间载体选择标记脓杆菌选择标记宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）最终受体植物的选择标记位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。外源基因插入pGV3850的过程外源基因KanrpBR322土壤农杆菌含pGV3850植物组织卡那霉素筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素的土壤农杆菌外源基因表达鉴定转化插入感染pBR322与pGV3850重组整合到染色体上pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物共整合转化程序②双元载体（binaryvectors）能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。双元载体的结构Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（10kb）Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）双元载体的转化基因插入转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。帮助质粒（helperplasmid）受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。左右外源基因双元载体Vir帮助质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源基因感染植物转化左右外源基因进入植物细胞核，整合，表达E.coli双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆位点、两个T-DNA双元系统中的Ti具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细胞中。穿梭质粒可在农杆菌内自主复制插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。双元系统的特点三、植物细胞的直接转化程序枪击法将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。基因枪介导的DNA转移•基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。GeneGunGenegunsandelectricshockstransferDNAintoplantcells基因枪电击法将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200-600V/cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2周，再生出整株植物。融合法将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。植物原生质体的再生程序四.转基因植物的基因鉴定转基因植物的基因鉴定方法1.表型2.选择压力-抗性基因3.PCR4.southern-blotting5.northern-blotting6.western-blotting7.后代遗传分析（一）利用转基因技术研究基因的表达与调控报告基因（reportergene）：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。（二）利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料（三）植物转基因技术在植物品种改良中的应用五、植物基因工程的应用目前植物中常用的报告基因：（1）大肠杆菌的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）该酶能催化许多β–葡萄糖苷酯类物质的水解，将其与X–葡萄糖苷酸（X-gluc）保温，产生蓝色反应，借此可预测报告基因的表达程度。（2）昆虫的荧光素酶基因昆虫荧光素和ATP以及表达荧光素酶的植物细胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成AMP、CO2和光，表达该酶的植物细胞或组织便可用感光胶片检测。（三）植物转基因技术在植物品种改良中的应用控制果实成熟的转基因植物抗病虫害的转基因植物抗除草剂的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物抗环境压力的转基因植物产高品质产物的转基因植物转基因育种的程序基因分离体外重组转化转化体安全性评价结合常规育种转基因品种遗传稳定性评价市场开发载体的构建农杆菌介导基因枪轰击筛选六.转基因植物研究发展1983年，转基因烟草、胡萝卜问世1987年，转基因油菜、棉花产生1988年，转基因水稻、玉米诞生1992年，培育出转基因小麦1994年，培育出转基因大麦2000年商业化种植面积比1996年翻了几倍预测：2020年世界上80％-90％的农作物将是转基因植物转基因植物的生产(图例)样品比较（左为普通棉花，右为兔毛转基因棉花）抗虫棉花抗除草剂作物抗CMV病毒转基因番茄抗CMV病毒转基因甜椒转查尔酮合酶矮牵牛花Resistanttothepapayaringspotvirus无籽茄子Improvednutritionalcontentanddelayedripeningaretransgenictraitsofinterestintomatoes.Source:USDA转基因油菜VeRicecapableofsynthesizingbeta-carotene,theprecursorofVitaminA我国转基因技术的发展正在进行中间实验的转基因作物48种，涉及作物11种，其中水稻、小麦、玉米、西红柿、白菜、甜瓜、花生和广藿香等为转基因食品植物正在进行环境释放试验的转基因作物49种，其中水稻、玉米、大豆、马铃薯、西红柿、甜椒和线辣椒为转基因食品植物2002年，种植面积突破210万公顷，成为继美国、加拿大、巴西、阿根廷之后的转基因作物种植大国转基因植物引发的安全事件英国Pusztai事件康奈尔大学斑蝶事件加拿大“超级杂草”事件墨西哥玉米事件中国Bt抗虫棉事件七、转基因生物潜在危害１、Pusztai事件Pusztai博士Killer“转雪花莲凝集素基因的马铃薯能够对大鼠的免疫系统造成损害”—1998年“导致大鼠体重及器官重量严重减轻，免疫系统被损坏”。英国皇家学会的评论1999.5不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成份有差异饲喂转基因土豆的大鼠未补充蛋白质以防止饥饿动物数量少，喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，很少统计意义统计方法不当试验结果无一致性Bt玉米马利筋斑蝶幼虫死亡44%（室内）２、斑蝶事件56斑蝶事件1999.5康乃尔大学研究组报道，撒在马利筋草叶片上的Bt玉米花粉，可使44%的斑蝶幼虫死亡Science、Nature拒绝发表斑蝶文章，审稿人指出这并不代表田间的情况转Bt基因的玉米造成帝王蝶的死亡嗎?对斑蝶的影响玉米花粉大而重，扩散不远。斑蝶通常不吃玉米花粉，在玉米散完粉后才大量产卵美国中西部Bt玉米占40％，但斑蝶群体数量很大斑蝶因杀虫剂而死亡的数量大大超过玉米花粉结论：转基因玉米对斑蝶不是一种威胁；在过去的几年里,尽管Bt玉米的种植面积增加了40%,但与此同时大斑蝶的种群也增加了30%。３、墨西哥玉米基因污染事件2001年11月29日,“轉基因DNA滲入墨西哥Oaxaca當地傳統玉米品種”一文在《Nature》上發表2003年，南京环境科学研究所薛达元发表了题为“转Bt基因抗虫棉环境影响研究综合报告”。“棉农“将面对不受控制的‘超级害虫’，转基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了更多的问题”，“棉农将被迫使用更多、更毒的化学农药”。4、中国Bt抗虫棉事件5、加拿大“超级杂草”事件由于基因漂流，在加拿大的油菜地里发现了个别油菜植株可以抗1-3种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”。这种油菜在喷施另一种除草剂2,4-D后即被全部杀死。6、美国转基因长粒米污染事件2006年8月，拜耳公司对外公布未经批准的转基因水稻少量混入商品稻米日本、欧盟宣布停止进口美国长粒米。结果导致多国禁止美