食品生物工程下游技术.

生物工程下游技术（四）初步纯化•萃取（extraction）•吸附（absorption）•沉淀（precipitation）萃取•萃取的原理：利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的。•萃取可提取和增浓产物，并可除去部分杂质•萃取包括溶剂萃取、超临界流体萃取、双水相萃取、反胶束萃取和凝胶萃取等。溶剂萃取和超临界流体萃取用于小分子物质的萃取，双水相萃取和反胶束萃取用于蛋白质等大分子的萃取。溶剂萃取-单级萃取实验室操作使含溶质的溶液和萃取剂接触混合，静止后分成两层。通常原料液是水溶液，萃取剂是有机溶剂，分层后，上层为萃取相，下层为萃余相。常用萃取溶剂：醇、酯、酮。杂质溶质原溶剂萃取剂Lightphase,萃取液Heavyphase,萃余液萃取效率不高，产物在水相中含量仍较高。工业生产最常用的萃取流程------多级萃取多级逆流萃取萃取效率最高，萃取剂用量最少。多级逆流萃取工业装置：超临界流体萃取：•物质的临界状态：其气态和液态共存的一种边缘状态。•超临界流体：当一种物质处于其临界点以上的温度和压力之下。•萃取原理：超临界流体具有象液体一样的流动性和象气体一样的扩散性，对物质具有很好的溶解性。超临界二氧化碳萃取•临界点：T：31.1℃P：7.4MPa•操作（1）等温变压法：萃取了溶质的超临界流体通过膨胀阀进入分离槽，压力下降，密度也下降，溶质溶解度下降而析出。（2）等压变温法：萃取了溶质的超临界流体经加热器升温后在分离槽析出溶质。（3）吸附法：萃取了溶质的超临界流体通过吸附分离器（内含只吸附溶质的吸附剂），使溶质与萃取剂分离。•优缺点：临界条件温和、产品分离简单、CO2便宜、萃取后无残留等。但设备投资大！•双水相萃取•反胶束萃取吸附•吸附原理：用固体吸附剂吸附溶液中的目的物质或杂质。•普通吸附剂：活性炭、磷酸钙、白陶土、硅藻土等。•活性炭：最常用的吸附力很强的非极性吸附剂；吸附能力：极性基团多极性基团少相对分子质量大相对分子质量小芳香族化合物脂肪族化合物酸性溶液中吸附力强，pH=5离子交换吸附•吸附原理：树脂上离子性功能团与溶液中的离子进行吸附。•树脂种类：强酸、弱酸、强碱、弱碱。强碱性物质选用弱酸性树脂，弱酸性物质选用强碱性树脂。•过程：溶液加入经预处理的树脂后进行吸附，吸附了目的物质的树脂从溶液中分离，再把目的物质从树脂上洗脱下来。洗脱条件与吸附条件相反。树脂可再生。沉淀•沉淀原理：利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。•沉淀方法：多价金属离子聚电解质非离子型聚合物特殊沉淀剂热沉淀其他沉淀法有机溶剂沉淀等电点沉淀盐析沉淀沉淀法盐析（saltingout）•盐析原理：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析是可逆的！•硫酸铵：溶解度大（25℃，767g/L，100%饱和度）•过程：通常在搅拌下，以少量多次方式缓慢加入，待加入的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。盐析沉淀后，需进行脱盐处理，再进行后续操作。脱盐的方法有透析（透析袋）、超滤。透析只用于除盐类和小分子杂质硫酸铵固体加入法（五）精细纯化•层析•电泳•层析：根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起溶质移动速度的不同而进行分离的方法。互不相溶的两相分别称为：固定相和流动相。•层析又称色谱或色层分离。属高度纯化技术。凝胶层析•原理：在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离。亦称分子筛层析。分配系数与相对分子量、分子形状、凝胶的孔径有关，与洗脱液的pH、离子强度无关。大分子先出来，小分子后出来！凝胶过滤介质•葡聚糖凝胶：商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系。•琼脂糖凝胶：商品名称Sepharose、BioGel。化学稳定性较葡聚糖凝胶差。•聚丙烯酰胺凝胶层析：商品名BioGel-P。化学稳定性好，有较高分辨率。分子筛凝胶层析的优、缺点及应用•优点：操作简便，分离效果好，重复性高，回收率高、分离条件温和、规模放大容易、应用广泛•缺点：分辨率低（根据分子大小的差别）洗脱后产品被稀释•应用：脱盐、相对分子量的测定Saltproduct亲和层析亲和作用：生物分子间识别并结合的相应一种物质的特异性相互作用称为亲和作用。亲和层析的原理：将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子（目标物质）容易从混合物中得到选择性分离纯化。亲和层析的操作载体活化、配基连接、吸附、清洗、洗脱、再生亲和层析的特点•效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。•分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物。•但通用性较差，洗脱条件苛刻。五、精细纯化•采用一些特殊的高新技术进一步把杂质与目的产物分离开来，包括层析、电泳、分子蒸馏等。5.1层析•层析技术又叫色谱分离技术。•常见有纸层析、薄层层析、柱层析等。纸层析和薄层层析操作简便，分辨率高，但分离量太少，主要用于定性和定量分析。柱层析进样量大，回收容易，可用于分离纯化。5.1.1凝胶层析•凝胶层析是利用生物大分子的分子量差异进行的色谱分离的方法。•凝胶色谱介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的色谱介质。目前已成为生物化工和生物制药领域研究和生产中必不可少的分离介质。凝胶色谱基本原理•凝胶色谱介质是一种在球体内部具有大孔网状结构的凝胶微粒，可以把大小不同的生物大分子按一定的顺序进行分离，分子量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径近，在柱内的停留时间短、保留值小，所以在色谱过程中迁移率最快，走在小分子的前面，先从色谱柱中流出。分子量小的分子由于能够进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒不同大小的网状孔流过，相对于大分子的迁移路径长，在柱内的停留时间长、保留值大，所以，在色谱过程中迁移率最慢，走在大分子的后面，最后从柱中流出。样品中分子量大小不同的各种分子在流过凝胶内部的网状孔时就受到凝胶介质排阻效应，也称为分子筛效应，将它们一个个分离，从而达到分离的目的。5.2电泳•原理是：蛋白质分子是两性大分子，在一定的pH缓冲液中，蛋白质或带正电，或带负电，或在等电点不带电。在电场作用下，带正电荷的蛋白质向负极移动，带负电的蛋白质向正极移动，处于等电点的蛋白质不移动。据此，可将两性大分子分离开来。电泳技术有凝胶电泳、等电点聚焦电泳等。5.3分子蒸馏•原理：液体分子受热会从液面逸出，而不同种类的分子在气相中运动的平均自由程不同来达到分离的目的。•分子蒸馏的原理是根据分子运动理论，液体混合物的分子受热后运动会加剧，当接受到足够能量时，就会从液面逸出而成为气相分子。随着液面上方气相分子的增加，有一部分气体就会返回液体。在外界条件保持恒定情况下，最终会达到分子运动的动态平衡。•分子运动的平均自由程与分子的有效直径的平方成反比。即分子有效直径大的分子运动的平均自由程短，分子有效直径小的分子运动的平均自由程大。此时如果在小分子能达到而大分子不能达到的距离上放一冷凝器，将小分子冷凝为液体，不断从气相中分离，平衡就被打破，液相混合物中的分子又会逸出成为气相分子。只要时间足够长，混合物就被分离提纯了。液体混合物沿加热板自上而下流动，被加热后能量足够的分子逸出液面，轻分子的分子运动平均自由程大;重分子的分子运动平均自由程小。如果在离液面距离小于轻分子运动的平均自由程而大于重分子运动的平均自由程处，设置一冷凝板，此时气体中的轻分子能够到达冷凝板，并不断地被冷凝，从而破坏了体系中轻分子的动态平衡，而使混合液中的轻分子不断逸出;相反，气相中的重分子因不能到达冷凝板，很快与液相中的重分子趋于动态平衡，表观上重分子不再从液相中逸出，这样液体混合物便达到了分离的目的。下图为分子蒸馏的原理示意图，其主要结构由加热器、捕集器、高真空系统组成。液体混合物沿加热板自上而下流动，被加热后能量足够的分子逸出液面，轻分子的分子运动平均自由程大;重分子的分子运动平均自由程小。如果在离液面距离小于轻分子运动的平均自由程而大于重分子运动的平均自由程处，设置一冷凝板，此时气体中的轻分子能够到达冷凝板，并不断地被冷凝，从而破坏了体系中轻分子的动态平衡，而使混合液中的轻分子不断逸出;相反，气相中的重分子因不能到达冷凝板，很快与液相中的重分子趋于动态平衡，表观上重分子不再从液相中逸出，这样液体混合物便达到了分离的目的。下图为分子蒸馏的原理示意图，其主要结构由加热器、捕集器、高真空系统组成。液体混合物沿加热板自上而下流动，被加热后能量足够的分子逸出液面，轻分子的分子运动平均自由程大;重分子的分子运动平均自由程小。如果在离液面距离小于轻分子运动的平均自由程而大于重分子运动的平均自由程处，设置一冷凝板，此时气体中的轻分子能够到达冷凝板，并不断地被冷凝，从而破坏了体系中轻分子的动态平衡，而使混合液中的轻分子不断逸出;相反，气相中的重分子因不能到达冷凝板，很快与液相中的重分子趋于动态平衡，表观上重分子不再从液相中逸出，这样液体混合物便达到了分离的目的。下图为分子蒸馏的原理示意图，其主要结构由加热器、捕集器、高真空系统组成。液体混合物沿加热板自上而下流动，被加热后能量足够的分子逸出液面，轻分子的分子运动平均自由程大;重分子的分子运动平均自由程小。如果在离液面距离小于轻分子运动的平均自由程而大于重分子运动的平均自由程处，设置一冷凝板，此时气体中的轻分子能够到达冷凝板，并不断地被冷凝，从而破坏了体系中轻分子的动态平衡，而使混合液中的轻分子不断逸出;相反，气相中的重分子因不能到达冷凝板，很快与液相中的重分子趋于动态平衡，表观上重分子不再从液相中逸出，这样液体混合物便达到了分离的目的。下图为分子蒸馏的原理示意图，其主要结构由加热器、捕集器、高真空系统组成。液体混合物沿加热板自上而下流动，被加热后能量足够的分子逸出液面，轻分子的分子运动平均自由程大;重分子的分子运动平均自由程小。如果在离液面距离小于轻分子运动的平均自由程而大于重分子运动的平均自由程处，设置一冷凝板，此时气体中的轻分子能够到达冷凝板，并不断地被冷凝，从而破坏了体系中轻分子的动态平衡，而使混合液中的轻分子不断逸出;相反，气相中的重分子因不能到达冷凝板，很快与液相中的重分子趋于动态平衡，表观上重分子不再从液相中逸出，这样液体混合物便达到了分离的目的。下图为分子蒸馏的原理示意图，其主要结构由加热器、捕集器、高真空系统组成。液体混合物沿加热板自上而下流动，被加热后能量足够的分子逸出液面，轻分子的分子运动平均自由程大;重分子的分子运动平均自由程小。如果在离液面距离小于轻分子运动的平均自由程而大于重分子运动的平均自由程处，设置一冷凝板，此时气体中的轻分子能够到达冷凝板，并不断地被冷凝，从而破坏了体系中轻分子的动态平衡，而使混合液中的轻分子不断逸出;相反，气相中的重分子因不能到达冷凝板，很快与液相中的重分子趋于动态平衡，表观上重分子不再从液相中逸出，这样液体混合物便达到了分离的目的。下图为分子蒸馏的原理示意图，其主要结构由加热器、捕集器、高真空系统组成。•液体混合物沿加热板自上而下流动，被加热后能量足够的分子逸出液面，轻分子的分子运动平均自由程大;重分子的分子运动平均自由程小。如果在离液面距离小于轻分子运动的平均自由程而大于重分子运动的平均自由程处，设置一冷凝板，此时气体中的轻分子能够到达冷凝板，并不断地被冷凝，从而破坏了体系中轻分子的动态平衡，而使混合液中的轻分子不断逸出;相反，气相中的重分子因不能到达冷凝板，很快与液相中的重分子趋于动态平衡，表观上重分子不再从液相中逸出，这样液体混合物便达到了分离的目的。下图为分子蒸馏的原理示意图，其主要结构由加热器、捕集器、