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第3讲荧光光谱1.荧光是怎么产生的？有什么用途？2.常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？3.荧光强度和物质浓度是什么样的关系?还有哪些因素会影响到荧光强度？4.荧光光谱的有哪些光谱参数？5.有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么用途？荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光和发射光频率之差称为斯托克频移。满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽，从X射线到红外光谱区仍然是荧光。其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等）也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如：钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。1.荧光介绍1）荧光产生及其物理机制S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时，荧光分子处于激发态。b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射跃迁过渡到低的能级。c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的作用，以及能量转移，过渡到低的能级d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命约为10ns左右。e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。如电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。荧光发光分为内源荧光和外源荧光。外源荧光应用很广，如染料结合作为荧光探针与蛋白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分子间距离等。荧光寿命和量子产率：荧光猝灭：荧光能量共振转移：时间分辨荧光光谱：荧光各向异性：荧光量子点标记，转基因荧光标记双光子荧光光谱2）荧光的应用2.常用荧光光谱1）荧光的激发光谱，发射谱激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。2).荧光光谱的特征a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2,l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似（振动波函数一样）；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。3.荧光光谱仪及使用技术光源激发单色器样品池检测器发射单色器检测器荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背景是没有入射光，是“暗背景”，因此灵敏度更高。1）荧光光谱仪I0dF薄层吸收的光强为：dxkceIeeIdIkcxdxxkckcx0)(0][溶液发出的荧光光强正比于吸收光强。]1[00kclkcxeAkIdxkceAIdIAF如果kcl1，进行展开，有kclkclkclkclekcl1!3)(!2)(1322）荧光强度和溶液浓度的关系样品池长度通常为1cm，因此荧光强度为cIKF0''荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。原因可能是：a浓度增加，分子碰撞机会增加，增加了非辐射损耗。b溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光）c吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收）d仪器原因3）.荧光光谱的环境效应4.荧光光谱参数1）荧光光谱参数：（1)荧光寿命和荧光量子产率去掉激发光以后，荧光强度并不是立即消失，而是以指数形式衰减。定义荧光强度降低到激发状态最大荧光强度的1/e所需要的时间称为荧光寿命。荧光寿命是个很重要的参数，可以不再对荧光的绝对强度进行测量。荧光寿命方程：/t0eFF公式中的τ即为荧光寿命荧光寿命和量子产率示意图Q为量子产率，为荧光发射速率，knr为非辐射转移速率,τn为荧光自然寿命.通常量子效率和波长相关，但生化的荧光通常和波长无关。/1k1kQnnrnr（2).荧光各向异性荧光偏振：荧光偏振（参数）：p=(F∥-F⊥)/(F∥+F⊥)荧光各向异性:γ=(F∥-F⊥)/(F∥+2F⊥)XYZF⊥F∥μaμeIp和同时描述荧光偏振。从对称性考虑，Fx=Fy,通常用描述荧光偏振p3p2rr22r3p各向异性与偏振度转换：5.荧光实验方法及其用途荧光猝灭荧光各向异性荧光能量共振转移时间分辨荧光光谱荧光标记双光子荧光光谱荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。狭义主要指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。原因：溶剂猝灭剂和荧光物质之间发生相互作用而引起荧光效率降低或激发态寿命缩短，导致强度降低。卤素离子、重金属离子、氧分子都是猝灭剂。研究主要集中在可测量的“狭义荧光猝灭”。生化方面主要应用猝灭现象指示分子之间的相互作用。揭示发色团和猝灭剂的接近程度，反映发色团在蛋白和膜上的局域位置，质子的通透性和膜的通透性。碰撞猝灭可以用来确定猝灭及的扩散系数。采用Stern-Volmer方程来解释1）.荧光猝灭（1）碰撞猝灭分析Lackowicz“Principleoffluorescentspectroscopy”Chapt8,p237-p265碰撞猝灭的Stern-Volmer方程F0/F=1+kqτ0[Q]＝1＋KD[Q]其中kq是猝灭速率τ0是无猝灭剂存在时的荧光寿命[Q]是猝灭剂的浓度F0/F～[Q]曲线。单一线性猝灭曲线预示所有发色团和猝灭剂是具有相同的可接近性。如果其中有一种不可接近，则Stern-Volmer曲线不是线性的。荧光发色团和猝灭剂形成不发荧光的复合物，吸收光以后，以无辐射跃迁的形式回到基态。解离常数为：][1]][[][][][][]][[][000QKFFQFFFKFQFFQFFQKsss与动力学猝灭的形式相仿，然而荧光寿命并没有发生改变。静态猝灭也是和猝灭剂呈线性关系，因此需要通过改变温度或测量荧光寿命来区分。kq～T/η（因为和扩散系数相关）另外可以通过测量吸收谱的方法确定。（2)静态猝灭2）荧光偏振（1）荧光偏振现象及用途一旦用偏振光照射，从许多样品出射的光也是偏振的。当样品各个方向出射的偏振光是不相同的，可以说样品显示出偏振的特性。研究偏振可以提供分子及周围环境更多的信息：偏振光照射到荧光分子上，分子对光的吸收和发射过程与分子框架相对偏振光的偏振方向相关。荧光偏振可以用来测量蛋白质的变形，蛋白质的结合以及蛋白质的内部动力学。与膜结合的荧光发色团用来估计膜的内部粘性以及居于相变温度之上的磷脂复合物的特性。XYZθφF∥F⊥设发射振子和Z轴夹角为Y为荧光检测方向（2）.荧光偏振的定量描述p=(F∥-F⊥)/(F∥+F⊥)2/)1cos3(3/231p12/)cos1(2/)1cos3(p21ddcoscossincoscossincoscosp22222222222（1）能量转移：Fluorescentresonanceenergytransfer（FRET)术语：Försterresonanceenergytransfer纪念德国科学家TheodorFörster3）.荧光能量共振转移TheodorFÖrster简介1910生于德国法兰克福，1933获Ph.D。1942年前，一直在研究有机复合物的光吸收。二次大战后，于1945年加入马克思普朗克研究所。1946年发表第一篇能量转移的文章。能量转移与供体的发射谱和受体的吸收谱的重叠、量子产率、距离、相对取向相关。激发态的供体能量被受体吸收，荧光强度下降。能量转移可能以两种方式：辐射和非辐射。共振转移的机制：偶极子相互作用通过非辐射进行能量转移（10nm)。荧光能量转移的先决条件：1)供体和受体有一定谱重叠（共振能量转移）。2)供体和受体距离比较近（正比于R6)。3）供体和受体跃迁偶极距的方向不能垂直（2）.能量转移的物理机制FÖrster公式：kT=kD(R0/R)6,kD=1/D如果波长采用cm，采用摩尔消光系数则：R0=9780(J(λ)к2n-4ΦD)1/6（单位为0.1nm)J=∫f(λ)ε(λ)λ4dλ（谱重叠积分）（3）Fret分析Lakowicz，JR.PrinciplesofFluorescentSpectroscopy,2ndEd,Chapt.13，p369.能量转移经常用于测定供体和受体的距离，称为“光谱尺”（spectroscopicruler），有时也会受到供体和受体的扩散影响。能量转移效率4).时间分辨光谱：输入脉冲，然后进行对接收的信号进行相应分析。时间分辨寿命；时间分辨各向异性。荧光各向异性可以采用稳态测量，也可以用瞬态方法进行测量。稳态测量是得到的是一个平均值，虽然容易解释，但需要做很多假设。瞬态测量是测量脉冲激发后的时间相关各向异性。可以直接从实验数据中观察得到并进行解释。各向异性与样品尺寸、形状以及标记分子的柔性相关，需要从各种分子模型进行计算拟合。各向异性衰减可以从TD或FD方法得到。目前还是采用时间分辨进行测量。一般情况下，要用水合体积进行计算旋转相关时间。如果是球形的样品，将会有单一衰减指数；大多数情况将会有多个衰减指数。原因主要是样品为非球形蛋白质或样品中有不同运动状况的荧光发色团。衰减时间与沿各分子轴的旋转相关。如果样品内部某些片断是柔性的，衰减时间也会改变。因此荧光各向异性可用于研究蛋白的内部动力学。能量转移也会影响各向异性衰减。在膜蛋白的研究中，通过各向异性衰减也有很多信息。（1）各向异性的时间相关特性•所得到的是平均结果。一般来讲，样品不会是完全均匀分布也不是高度有序。•利用瞬态测量寿命时，式中的时间寿命是基于只有一个衰减时间的假设。但如果有多组分，则需要取平均寿命。•另外采用有供体和受体时的荧光强度，用的是积分强度。•在固体样品中，可以克服样品在溶剂中旋转扩散的影响。•荧光猝灭，荧光能量共振转移都可以影响荧光的寿命，因此用时间分辨谱进行研究。（2）时间分辨寿命5.荧光标记有些物质不发荧光，而且生化分子中如氨基酸中只有少数残基发荧光，成为内源荧光。如染料与与研究对象结合，作为探针应用荧光方法与蛋白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分子间距离等。加入染料不应影响大分子的结构加入染料不应影响大分子的功能标在不同位置，效果不同。标记方法：1）有转基因标记：单点转基因标记:把某个氨基酸改变成Trp,或者转变成Cys再与荧光探针结合。荧光蛋白：在蛋白中插入含发色团的荧光蛋白，GFP,YFP,1）绿色荧光蛋白（GFP,greenfluorescentprotein）BFP2）量子点荧光标记量子点：QuantumDot•量子点又可称为半导体纳米微晶体。目前研究较多的主要是硫化镉、硒化镉和碲化镉（CdS、CdSe和CdTe）。•量子点由于粒径很小(约1～100nm)，因此光学行为与一些大分子相似,可以发射荧光。•量子点的体积大小严格控制着它的光吸收和发射特征。晶体颗粒越小,比表面积越大,分布于表面的原子就越多,量子尺寸效应越强,从而使其光吸收带蓝移,荧光发射峰位也相应蓝移。•单独的量子点颗粒容易受多种因素影响,荧光量子产率很低。但是当以其为核心,用另一种半导体材料包覆,形成核-壳结构后,就可将量子产率提高到约50%,甚至更高,因而有很强的荧光发射。目前已合成了多种核-壳结构的纳米颗粒,如CdS/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdS/