酵母蔗糖酶的提取及性质测定

酵母蔗糖酶的提取及性质测定引论及原理酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。蔗糖酶（invertase）（—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。（二）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂仪器1.高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2.电子天平、研钵（＞200ml）、制冰机、50ml烧杯3.离心管（2ml，10ml，30ml或50ml）、移液器（1000ul）或滴管、量筒材料及试剂1.市售鲜啤酒酵母（低温保存）＋H2O蔗糖酶OHHO2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液（四）操作步骤1.提取（1）将市售鲜啤酒酵母2000rpm，离心10min，除去大量水分。（2）将研钵稳妥放入冰浴中。（3）称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水，边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加75ml去离子水，研磨约40~60分钟，使其成糊状液体。（注：研磨时可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎）。（4）将混合物转入50ml（或分装入2个30ml）离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4℃，15000rpm，15min。观察结果：如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。（4）用移液器（或滴管）吸出上层有机相（弃掉）。（5）用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积，并记录。（6）取出2ml放入2ml离心管中（标记为粗级分I，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。2.热处理（1）将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。（2）取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量大小选择离心管），4℃，15000rpm，离心15min。（3）将上清液转入量筒，量出体积，并记录。（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为热级分II，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。3.乙醇沉淀（1）将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷的等体积（逐滴加入）95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。（2）转入清洁的离心管中，用4℃，15000rpm，离心15min，倾去上清，并滴干。（3）离心管中沉淀用5~8mlTris-HCl（pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊，则用离心管，4000rpm离心除去不溶物），转入量筒，量出体积，并记录。（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分Ⅲ，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。（注：离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理）（五）实验结果与分析记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。（六）注意事项二、DEAE-纤维素层析纯化蔗糖酶（一）实验目的学会离子交换柱层析法纯化蛋白的方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。（二）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂仪器1.核酸蛋白检测仪、自动部分收集器、蠕动泵、层析柱、梯度混合器2.滴管、真空泵或抽滤瓶、烧杯等。材料及试剂1.0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.3）2.0.5mol/LNaOH3.0.5mol/LHCl4.含100mmol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl（pH7.3）液5.DEAE-纤维素6.2%蔗糖溶液7．Benedict试剂：称取柠檬酸钠173g及碳酸钠（Na2CO3•H20）100g加入600mL蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释850mL。另称取17.3g硫酸铜溶解于100mL热蒸馏水中，冷却，稀释至150mL。最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸－碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。（四）操作步骤1.离子交换剂的处理（1）称取6克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加水浸24小时抽干（真空泵或抽滤瓶）后放入小烧杯中；（2）加入0.5mol/LNaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡0.5小时后抽干，用去离子水洗至近中性，抽干后放入小烧杯中；（3）加50ml0.5mol/LHCl,搅匀，浸泡0.5小时后抽干，用去离子水洗至近中性，放入小烧杯中；（4）用0.5mol/LNaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。本实验可直接用0.5mol/LNaOH浸泡1小时，抽干水洗至中性。因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收。按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5mol/LNaOH溶液处理，然后水洗至中性备用。2．装柱与平衡（1）先将层析柱垂直装好，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱（装量为柱长2/3或离柱顶端3~4cm，柱内纤维素要均匀，不要出气泡）；（2）用0.05mol/LpH7.3Tris-HCl起始缓冲液平衡（约100ml流出液即可），以流出液pH与缓冲液一致为准。3.上样与洗脱（1）将剩余小烧杯中的醇级分Ⅲ用滴管取1.5ml小心地沿柱壁加到层析柱中，不要扰动柱床。（注意上样量：分析用量一般为床体积的1%~2%，制备用量一般为床体积的20%~30%）（2）用滴管小心地沿柱壁加入起始缓冲液约5ml；（3）用0.05mol/LTris-HCl，pH7.3的缓冲液进行NaCl（0~100mmol/L）线性梯度洗脱。层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml0.05ml/LTris-HCl，pH7.3的缓冲液和50ml0.05mol/LTris-HCl，pH7.3的缓冲液，其中含100mmol/LNaCl。洗脱流速为0.5ml/分~1ml/分，使用部分收集器连续收集洗脱液，每管接收4ml。记录每管A280。至混合器中液体流完为止。（4）每隔4管（或取A280值高的几个峰值）做酶活力的定性测定，确定活性最高的几管合并（约20ml即可），转入量，量出体积，并记录。（5）取出2ml放入2ml离心管中（标记为柱级分IV，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分用于下一步实验。（标记为柱级分IV）。蔗糖酶活力的定性测定方法：取1干净试管加入2%蔗糖溶液1.5ml，蔗糖酶溶液0.5ml,37℃恒温水浴保温15分钟后，加入Benedict试剂1ml，沸水浴2~3分钟。观察桔红色沉淀多少。（五）实验结果与分析记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。（六）注意事项三、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定（一）实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力。掌握各步骤的实验原理和方法。（二）实验原理本实验以Nelson方法测定酶活力，其原理是还原糖含有的自由醛基或酮基，在碱性溶液中将Cu2+还原成氧化亚铜，糖本身被氧化成羟酸，砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液，在510nm下有正比于还原糖的吸收，从而可确定酶的活力，测定范围：25~200µg。本实验用考马斯亮蓝结合法测定蛋白浓度，考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250－蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250－蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。（三）实验仪器、材料及试剂仪器1.722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱2.量筒、容量瓶、移液器、试管。材料及试剂1.考马斯亮蓝(G250)染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（市售质量百分渡为85%），然后加蒸馏水定容至1000ml。2.0.9%NaCl溶液3.牛血清标准蛋白液（0.1mg/ml）：准确称取牛血清蛋白0.1g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至1000ml。4.4mmol/L葡萄糖、4mmol/L蔗糖、0.5mmol/L蔗糖。5.0.2mol/L乙酸缓冲溶液(pH4.5)：（1）0.2mol/LNaAC：称取27.616gNaAC溶解并定容至1000ml。（2）0.2mol/LHAC：100ml乙酸(分析纯)定容至500ml。（3）将两者分别取315ml、185ml混合，用强碱调pH到4.5。6.Nelson试剂：A试剂：100ml溶剂中含Na2CO32.5g，NaHCO32.0g，酒石酸钾钠（酒石酸钠）2.5g，Na2SO420g。B试剂：100ml溶剂中含CuSO4•5H2O15g，浓H2SO42滴。以A：B=50：2比例混合即可使用，使用前需在37℃以上溶解，防止溶质析出。7.砷钼酸试剂：100ml中含钼酸铵5g，浓H2SO44.2ml，砷酸钠0.6g。（砷酸钠有毒，实验中注意）（四）操作步骤1．各级分蛋白质浓度测定（1）蛋白质浓度测定――标准曲线的制备取7支干净试管，按表1编号并加入试剂混匀。以吸光度平均值为纵坐标，各管蛋白含量作为横坐标作图得标准曲线。（或将数据代入线性回归方程，求出Y？和r？）表1考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制编号0123456标准蛋白液/ml—0.10.20.30.40.50.60.9%NaCl/ml1.00.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝/ml4444444蛋白含量/μg0102030405060室温静置5minA595nm（2）各级分蛋白浓度的测定取9支干净试管，每级分做两管，按表2编号并加入试剂混匀。读取吸光度值。以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg的稀释度为宜。表2各级分蛋白浓度的测定编号1234粗级分I/ml热级分II/ml醇级分III/ml柱级分IV/ml0.9%NaCl/ml考马斯亮蓝/ml44444444蛋白含量/μg各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg的稀释