重组鲎C因子sushi蛋白中内毒素结合位点的确定和sushi多肽对内毒素的中和作用

重组鲎C因子sushi蛋白中内毒素结合位点的确定和sushi多肽对内毒素的中和作用NGUANSOONTAN,*MIANGLONPATRICIANG,*YINHOEYAU,*POOIKATWILLIAMCHONG,*BOWHO,†ANDJEAKLINGDING*,1*DepartmentofBiologicalSciences,†DepartmentofMicrobiology,NationalUniversityofSingapore,Singapore117543摘要：作为生物活性分泌重组蛋白产生的C因子，含有不同的sushi蛋白结构域，其三个截短的片段分别为sushi123，sushi1和sushi3结构域。sushi1和3各有一个Kd1029~10210M的高亲和力LPS结合位点，sushi123的正协同效应会在Kd2中增加1000倍。sushi1和3的核心LPS结合区域存在于两个34-mer肽，S1和S3中。一个二硫键结构的牢固结合不是必需的，但是对于LPS结合是十分重要的，正如所确认的亲和性下降了100~10000倍。S1和S3都能以不同的效价，抑制LAL反应和LPS诱导的hTNF-α的分泌。LAL试验显示，至少有两分子的S1按2.42的Hill系数共同结合到一个LPS分子上，而被S3结合的LPS则是独立进行，无需协同的。经过修饰的SD1和SD3肽展现出增强的LPS中和潜能，尽管它的亲和力只表现出10倍的提高。因此，在不改变它们对LPS的结合亲和力的条件下，四个sushi多肽的结构差异赋予了LPS不同的中和作用效率。圆二色谱测定显示出类脂A中存在四肽构象的变化，即从一种无规卷曲转变成α螺旋或β折叠结构。C因子对LPS的灵敏度有两个关键因素：1)单个的C因子分子上存在多个LPS的结合位点；2）LPS结合的高正协同效应。结果表明，在改进LPS的结合和中和肽的设计中，除了它的结构之外，其电荷平衡也是一项关键参数。关键词：鲎变形细胞溶解物；类脂A；果蝇S2细胞；脂多糖内毒素也被称为脂多糖(LPS)，它是革兰氏阴性菌外层的主要组成部分，并具有重要的病理生理功能。在被革兰阴性细菌感染时，LPS是宿主防御系统的体液免疫和细胞组分的重要激活剂，激活宿主防御来对抗这类感染是有必要的，但不受控制的刺激可能导致过度地释放炎症细胞因子，引起感染性休克和死亡。由内毒素的中和作用介导的毒性损伤，在很长时间内一直被认为是可能的治疗患者的药物作用靶点。在LPS分子中，存在三种遗传特性、生化特性和抗原性不同的区域：O-特异多糖侧链、核心多糖和类脂A。O-特异侧链由高度可变的重复低聚糖单位组成，它具有免疫原性，并能产生大量的血清，当O-抗原丢失时核心糖脂将会暴露，虽然在结构上相比O-抗原的可变性较低，但它仍然出现在许多类型的肠杆菌科细菌中（例如，沙门菌属）。LPS的促炎症生物活性存在于结构上最保守的葡萄糖胺基的磷脂上，即类脂A。因此，内毒素的中和作用通过类脂A，体现了一个治疗这种复杂的临床综合症，合理的、多层面途径的重要方向。我们在鲎变形细胞溶解物(LAL)中发现，溶液中只要有微量的LPS就可以激活凝血级联。三种丝氨酸蛋白酶原——C因子、B因子、凝血酶原和一种凝固蛋白、凝固蛋白原——已经被纯化并赋予某些特征。当LPS存在时，对LPS敏感的C因子，丝氨酸蛋白酶原会自催化激活，然后激活的C因子能够激活B因子酶原以激活B因子，随后激活凝血酶原以激活凝血酶，由此产生的凝血酶会将可溶性的凝固蛋白原（一种无脊椎动物的纤维蛋白原样物质）转换为不溶的凝固蛋白凝胶。作为凝血级联的最初激活物，C因子的功能是作为一个生物传感器，来响应LPS或类脂A。可想而知，C因子具有的LPS结合域展示出了对类脂A的异常高亲和性。所以，来自于C因子的LPS结合域将会结合并中和类脂A的生物毒性，并能与其他细菌的LPS发生交叉反应，因此可应用于感染革兰阴性细菌的败血症患者的免疫治疗。我们的实验室已经从Carcinoscorpiusrotundicauda(CrFC)中克隆出与C因子同源的cDNA。C因子是一种新型的包含5个sushi结构域的镶嵌蛋白，分别为一个表皮生长因子样、一个C型凝集素样和一个丝氨酸蛋白酶的结构域。除了这些结构域，一个富含半胱氨酸和一个富含脯氨酸的区域，也分别在H链的NH2末端和COOH末端被发现(图1)。最近，我们已经建立了带有多个类脂A结合位点的CrFC的氨基末端片段，还表达并赋予了一种分泌型CrFC的氨基末端区域一些特征，称为SSCrFCES。这种38kDa的蛋白质表现出了C因子的LPS结合域的高亲和力，并以2.2的Hill系数展现出与多个类脂A分子结合的高正协同性。SSCrFCES能够抑制内毒素诱导的LAL凝血反应，以及LPS诱导的由THP-1和正常人外周血单核细胞产生的细胞因子[肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-8]。这一C因子的区域，包括了富含半胱氨酸、表皮生长因子样和C因子的三个sushi域，可防止半乳糖胺致敏的小鼠因受LPS诱导致死。sushi域，也称作β2-糖蛋白I类结构域，含有两个二硫键。在本研究中，我们试图进一步定位和评估通过表达SSCrFCES的小功能sushi域，以及来源于SSCrFCES的合成多肽，所获得的多个内毒素结合位点。我们还测定了由多肽介导的对LPS诱导LAL的抑制作用，以及人类THP-1细胞对LPS诱导TNF-α分泌的抑制作用，并使用圆二色谱(CD)分析研究了多肽的结构活性关系。最后，我们评估了这些肽对半乳糖胺致敏的小鼠对抗致死内毒素攻击所提供的保护作用。材料与方法试剂图1A）C因子的域结构以及截短的C因子表达载体。PAc5/SSCrFCES-V5-His可产生SSCrFCES蛋白。SSCrFCES截短片段的相对位置已作为开放盒举例说明。我们通过PCR得到了一个sushi123的片段。我们进行了由1×PCR缓冲液组成的总量为100mL的PCR反应；200mMdNTPs、0.3mM引物、10ngDNA模板和1单位的VentDNA聚合酶(NEB公司)，PCR的最佳条件为s123正向引物(59-GGAGATCTGGTGCACTGTGAAATTCTC-39)和s123反向引物(59-GCACCGGTCTGTCACAGTCGACCTCT-39)，反应条件为变性（94℃，5分钟）、退火（50℃，1分钟）和延伸（72℃，1分钟）。在最后一次延伸（72℃，5分钟）前，这些条件将会再重复30个周期。B)我们运用抗GFP抗体（试剂盒）进行免疫印迹分析，并使用SuperSignal化学发光法使其可视化。代表49、35、35和27kDa的特定条带分别对应着sushi123-EGFP、sushi1-EGFP、sushi-3EGFP与控制型EGFP，可确定它们为仅有的被分泌和纯化的带有多组氨酸标签的蛋白质。我们使用Biomax胶卷（柯达）的曝光时间只限于5s。以下是已鉴定出的泳道：1基准：预染的蛋白质标准分子量（Gibco，BRL）；2SSEGFP培养基；3sushi123-EGFP培养基；4sushi1-EGFP培养基；5sushi3-EGFP培养基；6重组GFP控制线（0.1μg）。C)12%的考马斯亮蓝染色，降低了初始和部分纯化的sushi::EGFP蛋白的SDS-PAGE轮廓。用阴离子交换色谱法纯化的融合蛋白可占总蛋白60-80%，这些部分纯化的融合蛋白，可与抗GFP抗体联合用于SPR研究。以下是已鉴定出的泳道：1基准：预染的蛋白质标准分子量（Gibco，BRL）；2控制培养基（20μg）；3初始sushi123培养基（20μg）；4部分纯化的sushi123培养基（1μg）；5初始sushi1培养基（20μg）；6部分纯化的sushi1培养基（1μg）；7初始sushi3培养基（20μg）；8部分纯化的sushi3培养基（1μg）。从Escherichiacoli055:B5、E.colif583、S.minnesotare595、S.typhimuriums1684和S.flexneri中所得的LPS和类脂A（4-单磷脂酰-及1,49-焦磷酰形式）购自于Sigma公司（圣路易斯，密苏里州）；而从E.coliK12,D31me中所得的类脂A来自于List生物实验室公司（坎贝尔，加利福尼亚州）。果蝇表达系统和培养基来自InVitrogen公司（圣地亚哥，加利福尼亚州）。LAL试剂获赠于BioWhitaker公司（沃克斯维尔，马里兰州）。用于LPS刺激研究和昆虫细胞检测潮霉素的培养基来自于Gibco,BRL（格兰岛，纽约州）。低内毒素确定的胎牛血清(FBS)是从Hyclone公司（洛根，犹他州）购买的。用于激活THP-1细胞的佛波酯(PMA)和半乳糖胺分别来自于Sigma-Aldrich公司（费尔劳恩，新泽西州）和CalBiochem公司（圣地亚哥，加利福尼亚州）。用于TNF-α的免疫分析法从PharMingen公司（圣地亚哥，加利福尼亚州）购买。用于细胞毒性分析的CellTiter96Aqueous来自于Promega公司（麦迪逊，威斯康辛州）。纯化GFP蛋白从Clontech公司（帕洛阿尔托，加利福尼亚州）购买。寡核苷酸由Genosys生物技术公司（伍德兰，得克萨斯州）合成。用于DNA操作和聚合酶反应的酶从NEB公司（贝弗利，马萨诸塞州）和BoehringerMannheim公司（曼海姆，德国）购得。所用的DNA纯化试剂盒来自于Qiagen公司（查特斯沃思，加利福尼亚州）。用于配制缓冲液的无热原水来自于Baxter公司（莫顿格罗夫，伊利诺伊州）。多肽C因子介导产生的多肽由Genemed合成公司（旧金山，加利福尼亚州）合成与纯化。第一条多肽（9N9-GFKLKGMARISCLPNGQWSNFPPKCIRECAMVSS-9C9）与CrFC氨基末端的第171–204个残基一致，把其定名为S1(171–204)，其分子量[MW]为3758。第二条多肽(9N9HAEHKVKIGVEQKYGQFPQGTEVTYTCSGNYFLM-9C9)与第268–301个残基一致，把其定名为S3(268–301)，其分子量为3892。两处赖氨酸突变分别被引入S1和S3，引起SΔ1(171–204Δ177,179)[MW,3727]和SΔ3(268–301Δ276,278)[MW,3962]。这些多肽的纯度都大于95%。分泌的sushi::EGFP融合蛋白的结构pAc5.1S123EGFP、pAc5.1S1EGFP和pAc5.1S3EGFP分别包含了CrFC的sushi123、sushi1和sushi3结构域（图1A）。修饰后的pEGFP-N1为这项研究的克隆构建提供了便利，它包括了插入的分泌信号(SS)上游，以及框内增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，把其称为pSSEGFP。克隆的第一步涉及一条包含CrFC的sushi123域的616bp双链DNA片段的聚合酶链反应(PCR)扩增。PCR的模板为搭载全长CrFC、pAc5.1/CrFC的重组pAc5.1/V5-HisA质粒。在平末端PCR产物被引入pBluescriptIISK扩增之后，sushi片段被切开，并将整个(即Sushi123)或部分（即Sushi1和Sushi3）插入到pSSEGFP中，sushi结构域被插在SS和EGFP的框内之间，接下来将这三部分结构通过EcoRV和NotI位点转入pAc5.1/V5-HisA中。起始和终止密码子分别位于SS和EGFP。