转基因大豆

一、国外转基因大豆新品种培育研发的基本流程以现有大豆品种作为受体材料，利用基因工程手段，构建重组植物表达载体，用农杆菌介导法和基因枪法两种方法将目的基因导入大豆，获得转基因植株，分析其对疫霉根腐病的抗病性，筛选出抗病大豆新株(品)系。由于根癌农杆菌介导的转基因技术体系具有插入基因拷贝数低、遗传稳定、转化过程相对简单、成本相对低廉等诸多优点，一直是植物转基因研究的首选技术，在大豆中亦是如此。自Hinchee等于1988年建立根癌农杆菌介导的大豆子叶节器官发生转化系统之后，许多实验室以此为基础开展了优化、改进工作和转基因材料创制研究，也使该技术体系成为了最为重要的大豆转基因手段。在根癌农杆菌介导的大豆转基因技术体系建立的同时，基因枪介导的大豆转基因技术体系也获得了成功。尽管基因枪介导的转基因技术体系存在多拷贝插入频率高、断裂的DNA片段插入难以避免、转基因后代遗传稳定性较差等缺点，但由于其受基因型限制较小，操作流程相对简单、遗传转化相对较易实现等优点，仍是植物转基因研究的重要手段之一。在大豆遗传转化较为困难的现实条件下，其在大豆中的使用依然较为普遍，特别是在利用转基因大豆材料进行基因功能分析的研究中更为常见。二、如何有效减少转基因后代材料中目的基因沉默或丢失的现象1、避免基因间的同源性由于重复或同源序列是基因沉默的普遍诱因，因此，在构建表达载体时，尽量降低所设计的序列与内源基因的同源性，以减少或避免配对。应尽量使外源DNA碱基组成与植物DNA碱基组成相一致，以避免被植物限制修饰机制所识别。同时，也可以采用定点插入方法，将外源基因插入到具有与其相似碱基组成的染色体区域。另外，在育种过程中要选择外源基因表达稳定的株系。2、避免重复序列的出现基因枪法以及电激法等直接DNA导入法易引起多个拷贝基因整合，使用根癌农杆菌介导法转化植物可在一定程度上避免这一问题。因此在进行植物转化时，应优先考虑使用后一方法。同时，在筛选作为育种材料的转基因植株时，应尽量选择单拷贝插入的个体，来减少重复序列的存在。3、消除甲基化的影响鉴于转基因甲基化程度与转基因沉默的程度成正相关，即甲基化是基因沉默的直接原因。在载体上加上有去甲基化功能的序列以防止甲基化。如目前已知用5-氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用。但由于其价格昂贵，兼有致癌性，因此实用价值不高。4、MAR的使用使用核基质结合区（matrixattachmentregion,MAR）序列是克服外源基因沉默的有效方法。MAR是染色质上的一段DNA序列，又称之为核骨架结合区(scaffordattachmentregion)。把MAR构建到外源基因的两侧，使它们在转基因植物的染色质中形成独立的区域，这样不但可以避免外源基因表达位置效应的影响，而且还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。5、使用诱导型启动子大多数的科研工作都是使用组成型强启动子，不过诱导型的启动子迄今仅在少数植物中获得了转基因植株。如用于双子叶植物转化的花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子。三、目前国内外研发机构主要采用的大豆遗传转化方法及其优缺点目前大豆遗传转化的方法较多，主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、PEG法、显微注射法、电激法、超声波辅助农杆菌转化法等，其中常用的方法有农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法。1、农杆菌介导法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，该细菌能够在自然条件下有趋化性的感染大多数双子叶植物的伤口部位，并能够诱导其产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated)中应用的主要有根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)，这两种菌的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段转移DNA(T-DNA)，在病原菌致病过程中，即农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，植物微伤口分泌的乙酞丁香酮(AS)作为信号因子诱导农杆菌中的vir基因的表达，使农杆菌附着在植物细胞上，但此时只留在细胞间隙中，而后启动T-DNA的进一步加工、剪切、复制，最终进入植物细胞并整合到植物核基因组上，并稳定表达。农杆菌介导的遗传转化具有以下优点:技术操作简单、经济成本低#可靠性高，外源基因通常以单拷贝或者低拷贝的形式插入到植物基因，其转化率相对较高，可以转化的外源基因片段较大(50kb)，并且没有明显的基因重排现象，但大豆转化的效率受到农杆菌菌株感染转化能力、大豆基因型、组织培养条件和转化后的筛选模式等因素影响，目前仍需要突破性改进。2、基因枪法基因枪转化法(Particlebombardment)主要是通过物理介导的方法将外源的DNA分子导入植物细胞、组织、器官或原生质体中，并实现在植物基因组中的整合。该方法利用低压气体加速以包被着DNA的金粉颗粒或其他惰性金属颗粒轰击植物组织细胞，广泛应用于对农杆菌侵染不敏感的植物的遗传转化中。与农杆菌转化法相比，其优点在于该方法对外植体的基因型没有依赖性，具有相对高的转化率，而且可转移多拷贝的重组DNA或者DNA片段;而缺点则是该方法耗资较大，转移的外源基因片段相对较小(10kb)，易发生基因重组，转基因植株还容易出现嵌合体等。3、花粉管通道法花粉管通道法(Pollen-tubepathway)的原理主要是当植物授粉后开花、受精过程中会形成花粉管通道，此时将含有目的基因的DNA溶液注射进该部位，使得外源DNA可经过珠心通道进入胚囊，对尚未发育完全的胚胎细胞进行转化，通过观察后代的变异，最终筛选出转基因植株。花粉管通道法的优点是操作简单、不依赖于复杂的组织培养过程，可将目的基因DNA片段直接导入，而不需要报告基因等，因此，不会带入多余的载体骨架，环境安全性较好。但是该方法转化大豆效率较低且可重复性不高，受到花期和环境影响较大，后代筛选难度较大。四、大豆遗传转化技术中，如何有效降低大豆转化苗嵌合体的比例解决大豆遗传转化中的嵌合体问题，国内外的研究者对不同途径的大豆的再生体系进行了研究和优化。1、大豆体细胞胚胎发生途径再生体系大豆体细胞胚胎发生再生系统是目前大豆再生系统研究的另一个重要部分,被认为是解决大豆遗传转化中嵌合体问题的最有潜力的再生体系。采用胚性细胞团作为外植体,由于其位于表面,且能在很多位置形成体细胞胚,因此转化筛选都很容易。采用液体悬浮培养法使胚性细胞团高速增殖,且在筛选时与筛选剂接触充分,使得只有转化部位的细胞可以增殖,因而能进行有效筛选,理论上可以解决嵌合体问题。2、大豆原生质体再生体系原生质体转化是转化单个细胞,因此是克服嵌合体最有潜力的再生系统,但是再生频率较低、操作较为复杂、转化方法受到限制,可重复性较差。3、子叶再生体系以子叶作为外植体,主要用于基因枪法的转化,叶片面积小,较为经济,同时它还可以克服以子叶节诱导丛生芽转化所产生的嵌合体。子叶是目前为止研究比较成熟的再生体系,可以作为大豆遗传转化的受体材料,实现基因转化。五、国内外转基因大豆研发趋势转基因技术应用最广泛的领域之一就是转基因大豆（geneticallyengineeredsoybean，简称GE大豆），其研制最初是为了配合草甘膦除草剂的使用，人们提到的转基因大豆也多数指抗除草剂转基因大豆（RoundupReadysoybean，抗除草剂转基因大豆）。目前除了RR大豆外，国际市场上还有另外两种转基因大豆系列。它们分别是转基因抗除草剂[针对gluphosinat（e草丁磷）]以及转基因高油酸大豆（HighOleicAcidTransgeneticSoybean）。1、技术方面总的看来大豆细胞和大多数植物一样可以用来进行有效的转化。但到目前还没有一种高效、稳定、快捷、简便的用于大豆转化的再生体系、现有的再生系统也不能与当前植物遗传转化方法很好地结合、这是限制大豆转基因技术发展的关键因素。建立一个适用于大豆转基因的高效再生受体系统、并对转基因方法进行优化和创新、摸索出一条有利于转化频率提高的新体系、才有可能使大豆转基因成为一项规模化技术体系、为生产实践服务。2、育种方向除单一性状如抗除草剂和抗虫性的改良外，事实上，大豆遗传转化已经在多个研究领域取得成功。在未来的相当的一段时间内，除继续重视单一性状如抗除草剂和抗虫性的改良外，加强大豆的营养品质(如:脂肪酸组成、氮基酸成分和植酸磷含量等)，采用双抗基因或多抗基因转化以及将大豆作为生物反应器生产高价值蛋白药物等领域将是转基因大豆育种的重点方向。3、安全性评价应用转基因作物具有极大的经济效益的同时，也存在一定的风险，包括对环境、食品的安全性、抗性基因的稳定性及抗性杂草发生影响等。大豆是人类可食用的最重要的植物蛋白质之一。由于转基因大豆安全性存在不可预见性，因此，必须要对其进行长期监控。每一种新研制的转基因大豆都必须通过个案处理，评估其可能存在的风险，以确保进行环境释放和市场释放时转基因作物及其加工的食品具有高度的安全性。六、目前我国转基因大豆研发中存在的关键问题及其解决措施大豆遗传转化技术不断完善，根癌农杆菌介导法和基因枪法快速发展，其转化效率不断提高。但与其他主要作物（如水稻、玉米等）相比差距较大。根癌农杆菌介导法流程相对简单、仪器设备便宜、拷贝数低，且转基因较少沉默，可转移基因片段较长。由于受大豆基因型、组织类型、时龄（Age）、菌液浓度和培养温度等众多因素的影响，其转化效率较低（3%）；需要精细的人工操作，且不定芽源于多细胞，所形成的再生植株有较多的嵌合体，加大了后代的筛选难度；各个实验室间的转化率差距较大，重复性差，应用受到限制。而基因枪法基因沉默和拷贝数多，且其耗资大、技术难，微弹难以完全覆盖靶组织，转化有效性受到限制。近年来，不断有新的方法（如花粉管导入法和晶须介导法）、新的菌种（发根农杆菌）和新的受体材料等出现，但由于方法自身特点，在大豆中的应用尚未普及。在基因克隆、载体构建和转化方面都尽量减少选择基因使用，如花粉管导入法，以及利用双T-DNA，一个载体中含有选择标记基因（bar），另一个载体中含目的基因（AAD-12），获得只含AAD-12转基因大豆。此外，减少载体骨架整合率、基因精确定位以及多基因共转化也是未来大豆遗传转化的发展趋势。