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马齿苋中黄酮类化合物不同的萃取技术的比较研究采用紫外-可见分光光度法分析朱宏斌王玉芝刘宇轩夏亚林唐天摘要：马齿苋在中国是一种传统的食用和药用植物。黄酮类化合物是这种植物的主要活性成分之一。本文对五种马齿苋中黄酮类化合物的提取技术进行了研究和比较，包括微波辅助提取，超声波提取，回流提取，索氏提取和浸泡提取。结果表明，微波辅助提取最适合马齿苋中黄酮类化合物的提取，因为它提取效率高和提取时间短。找到的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为70%（v/v），料液比为1:50，提取温度为50℃，照射时间为9分钟。通过紫外可见分光光度法，显色体系NaNO2–Al(NO3)3–NaOH溶液进行定量分析。在最佳条件下，分析物的校准曲线线性相关系数大于0.9999。平均回收率为102.6%，RSD为1.13%（N=5）。对八种不同生活习性的马齿苋进行了调查。总黄酮含量分别为7.16，7.10，9.38，6.82，6.78，11.36，5.12，1.76mg·g−1。关键词：食品分析马齿苋黄酮类化合物微波辅助提取紫外可见分光光度法介绍马齿苋（马齿苋，马齿草）是一种常见的，肉质草本的一年生杂草，广泛分布于全球温带和热带地区（拉达克里希南等，2001；加尔蒂等，1999）。在中国几千年来它作为一种食用和药用植物。马齿苋营养丰富，富含蛋白质，碳水化合物，钙，钾，锌和钠（2008年Aberoumand）。作为中国传统医药的一种，马齿苋是非常重要的，因为其特殊的医疗功能，它已被用于传统治疗血痢和外部疖疮，湿疹，丹毒昆虫和蛇咬伤（Chen等2003;Zhang等2002;YAZICI等，2007;Palaniswamya等，2004）。在许多中药材的有效成分中，黄酮类化合物是植物王国中最常见的化合物之一。黄酮类化合物已受到广泛关注，因为它们的物种数量的丰富性和有效性，在降低血脂，抗氧化，吸收胆固醇，抑制血栓形成，扩张冠状动脉等方面具有显著疗效（Deng等，2008年；DeSouzaetal，2008；Suetal2008；shao等，2007；VolpiandBergonzini，2006；zhang，2007；KeithKeith等，2007）。近日，黄酮类化合物在医药和食品领域的发展已经成为研究的热点。黄酮类化合物和多糖类是马齿苋中含量最丰富有效的组件。据悉，在马齿苋中已发现7种黄酮类化合物，包括槲皮素，山奈素，杨梅素，芹菜素，木犀草素，染料木素和染料木苷（Chen等2003；Zhang等2007）。并具有很高的生物活性，高含量的黄酮类化合物的提取和分离在医疗、食品等行业是非常重要的。因此，研究马齿苋中黄酮类化合物的提取和测定技术是具有非常重大意义的。在传统方法中，从马齿苋中提取黄酮类化合物通常是通过浸泡和回流的方法进行提取。作为一个新兴的提取方法，超声波提取也被用于黄酮类化合物的提取（Jin等，2008；Chen等2008）。但不幸的是，马齿苋中的黄酮类化合物不能由上述方法充分地提取，由于提取液的杂质含量高和提取时间长，它在医药的发展中受到一定程度上的限制。因此，有必要开发一个更有效和更可靠的提取方法。微波辅助萃取似乎有希望实现这一目的。微波辅助提取法具有很强的穿透力，选择性高，加热能力强，溶剂消耗少，提取时间短，提取率高（Ganzler等，1990）的优势，并作为一种新的提取技术，它特别适合用于提取热敏性成分和天然活性成分（Chen等，2008）。在本文中，压力自控微波分解系统被用来从马齿苋中提取黄酮类化合物时可以将系统的温度控制在一定值。因此，它可以有效的避免热敏感的组分的损失。在本研究中，微波辅助萃取，一个简单而有效的方法，已经研制成功。同时，为了证明微波辅助萃取的优点，对各种方法提取黄酮类化合物的提取效率进行了比较。对药用植物中黄酮类化合物的含量测定的几种方法已被报道，包括薄层色谱法，高效液相色谱法，毛细管电泳法和紫外可见分光光度法。所有这些方法中，只有紫外可见分光光度法可用于测定总黄酮的含量。紫外可见分光光度法是在确定植物中总黄酮含量时使用最广泛的方法。在这项技术中，直接测定法和染色方法都是比较常见的，但显色方法比直接测定法更好，因为显色方法不受其它成分如多糖和皂甙的干扰。在这项研究中，我们提出了一个简单的方法，采用紫外可见分光光度法与NaNO2–Al(NO3)3–NaOH显色体系，以确定马齿苋中总黄酮的含量。材料和方法样品采集为了探讨不同月份采集的马齿苋中的总黄酮含量，本实验以三种不同的马齿苋样品作为实验材料。三个样品的中医（TCM）样品购自中国传统医药有限公司（湖南，中国）；一个中药样品于2007年8月收集，另一个中药样品采集于2007年7月。我们收集的第三个样品（野生马齿苋）于2008年6月在长沙（湖南，中国）郊区采集。样品制备将新鲜样品用清水清洗干净，一部分新鲜样品被分割为根，茎，叶进行研究。所有的样品在50℃下干燥后，由植物研磨机粉碎成细小的粉末样品并保持干燥。药品和仪器1、药品：标准芦丁对照品（97%），购自国药集团化学试剂有限公司（中国）。所有在这项工作中所使用的试剂和化学品均为分析纯。在整个研究过程中均使用三重蒸馏水。2、仪器：压力自控微波分解系统（MDS-2002AT，上海，中国）。自动科学AS-2060B超声波清洗机（天津，中国）。索氏提取器（250毫升，长沙，中国）。高速离心机（TGL-16C，上海，中国），以加速分离的过程。一种多功能植物粉碎机（FW-100，北京，中国），用来使植物材料粉碎成为粉末。旋转蒸发器（RE52CS，上海，中国），用来浓缩样品溶液。V-530紫外可见分光光度计（JASCO，日本），用于测定总黄酮的含量。总黄酮提取工艺在马齿苋提取之前，需用多功能植物粉碎机将其粉碎成粉末。通过索氏提取器，用石油醚对样品粉末进行脱脂，直至洗脱液的颜色变为无色。从马齿苋中提取黄酮类化合物的五个提取方法如下：1、微波辅助提取准确称取样品的粉末（0.5g），加入25ml乙醇–水（70:30，V/V）溶液，并放置在密封的容器中，然后放入密封容器置于压力自控微波分解系统进行微波辅助提取。提取温度为50°C，照射时间保持在9分钟。微波辅助提取后，将提取液以11000rpm的转速离心30min；上清液在容量瓶（25ml）中用乙醇–水（70:30，V/V）溶液稀释至25ml。2、超声波提取准确称取样品的粉末（0.5g），并放置在密封容器内，加入25ml乙醇–水（70:30，V/V）溶液，然后密封容器置于超声波清洗槽中在室温下（25℃）超声提取一个小时。然后进行后续工作（按照微波辅助提取的说明进行操作）。3、冷凝回流提取准确称取样品的粉末（0.5g），并放置在密封容器内，加入25ml乙醇-水（70:30，V/V）溶液，然后放入密封容器的回流装置中，进行2.5小时的回流提取。然后进行以下工作（如微波辅助提取中的说明）。4、索氏提取准确称取样品的粉末（0.5g），并置于索氏提取器中，加入80ml乙醇-水（70:30，V/V）溶液，随后提取5小时，然后浓缩提取液。然后进行以下工作（如微波辅助提取中的说明）。5、浸泡提取准确称取样品的粉末（0.5g），并放置在密封容器内，加入25ml的乙醇-水（70:30，V/V）溶液，然后在室温（25°C）下提取48小时。然后进行以下工作（如微波辅助提取中的说明）。总黄酮含量测定首先，准确量取2毫升样品溶液加入在容量瓶（10ml）中，加入0.6ml的亚硝酸钠溶液（5%），摇匀，静置6分钟。其次，将0.5ml的Al（NO3）3（10%）溶液加入到量瓶中，摇匀，静置6分钟。最后，加入3.0ml的NaOH（4.3%）溶液到容量瓶中，然后加入水至刻度，摇匀，放置15分钟进行测定。无着色的作为对照品溶液，样品溶液用染色方法处理，500nm为测定波长采用紫外可见光检测器确定样品中总黄酮的含量。标准溶液的制备芦丁标准溶液（0.16mg/ml）的制备方法如下：准确称取芦丁（200mg），并用乙醇-水（70:30，V/V）的溶液溶解，然后将该溶液用乙醇-水（70:30，V/V）溶液在容量瓶（100ml）中稀释至100mL。准确量取上述溶液2ml，并在容量瓶（25ml）中由乙醇-水（70:30，V/V）的溶剂稀释至25毫升。标准曲线分别准确量取芦丁标准溶液6份（0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，和2.4ml），置于6容量瓶（10ml）中，然后进行如下操作（如在测定黄酮类化合物的描述）。以芦丁标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，建立了线性图和标准曲线如图1所示，回归方程为A=0.00171+−11.58482c（R=0.9999）。图1：标准曲线图2：黄酮类化合物和显色体系的显色反应结果与讨论黄酮类化合物和显色体系的显色反应黄酮类化合物的基本结构示于图2a中，马齿苋中的黄酮类化合物大多数有3'，4'-二羟基取代的结构（在图2b中所示）。黄酮类化合物中的3'，4'-二羟基取代的结构，与亚硝酸钠（NaNO2）的Al（NO3）3-NaOH缓冲溶液的系统可以显示特殊的颜色反应。黄酮类化合物在图2C中呈现显色体系的显色反应。如图2所示，这种方法是基于黄酮类化合物与铝离子在碱性介质中形成红色螯合物。通过测量这些红色螯合物的吸收度，以确定它是可能的黄酮类化合物。图3：芦丁和样品溶液的紫外可见光谱图检测波长的选择进行紫外扫描（如图3）是为了确定检测波长。制备芦丁溶液和样品溶液（如测定黄酮类化合物的描述）。从图3，我们可以看到，芦丁溶液和样品溶液在可见光范围内的最大吸收波长为500nm，所以可以选择目标分析物的检测波长为500nm。不同溶剂提取效率的比较微波辅助提取提到的三个提取溶剂，包括甲醇-水，乙醇-水，丙酮-水从马齿苋中提取黄酮类化合物，检查他们的效率，并将结果显示在图4。从图4，我们可以看到，用乙醇-水从马齿苋中提取黄酮类化合物提取的效率最高。图4：溶剂对提取效率的影响提取方法的选择对五个不同的提取方法进行了研究，其中包括微波辅助提取，浸泡提取，索氏提取法，回流提取，超声提取，用紫外可见分光光度法对这些样品的总黄酮含量进行测定。其结果示于表1。从表1中所示的结果中，我们可以发现，微波辅助提取的提取效率最高。与索氏提取法相比，微波辅助提取的提取时间缩短了97%，与回流提取法相比，提取时间缩短94%。微波辅助提取法从马齿苋中取黄酮类化合物是一种快速，高效，经济的方法，它不像古典导电加热方法，由于微波射线是极具穿透力的微波可以同时加热整个样本。微波射线穿过的微波透明的提取介质，并到达植物材料内部维管束和电池系统。其结果是材料内部的温度突然上升，内部压力超过细胞壁的扩张能力，使细胞壁破裂，细胞内的物质就可以自由地流出来，为提取液。因此，微波辅助提取法的提取效率最高，它是最适合从马齿苋中提取黄酮类化合物的方法。微波辅助提取条件的优化有许多因素影响从马齿苋中提取黄酮类化合物，通过单因素试验，我们计算出各因素的最佳水平。然而，由于各因素之间的相互作用，各因素的最佳水平的组合效果可能不是最佳提取条件。正交试验法是安排多因素的一种科学方法。在单因素试验的基础上，最佳提取条件可以通过正交试验计算出。在本文中，微波辅助提取的最佳提取条件通过单因素试验和正交试验确定。1、单因素试验影响提取率的因素很多，其中提取溶剂，固液比，微波辐射时间和提取温度是主要因素。单因素试验是一个因素具有不同水平的变化，而其他因素固定。（a）提取溶剂的选择对上述三个不同强度的溶剂提取进行研究，微波辐射的其他条件保持相同（料液比为1:30，提取温度为35℃，提取时间为5分钟）。如图4所示，吸光度是最高的提取溶剂是70%乙醇（V/V），所以在下面的实验中选择70%的乙醇-水（V/V）溶液。（b）固液比的选择通过不同固液比1:10（g/ml），1:15，1:20，1:30，1:40和1:50的提取，以及其他条件的微波辐射保持相同（70%乙醇-水溶液，提取温度为35℃，提取时间为5分钟）。如图5所示。从1:15至1:40的比例增加时提取效率增加，然后1:40-1:50比