生物材料检验复习资料

生物材料检验：分析检验生物材料中化学物质及其代谢物的含量或因化学物质引起的的生物效应指标变化。生物材料：是人体体液（如血液）、排泄物（如呼吸气、尿液）、毛发，指甲以及组织脏器等的总称。生物标志物：指生物系统接触外源性物质后出现的一种变化。分为三类：接触性生物标志物、效应性生物标志物，敏感性生物标志物。生物接触限值（BEL）：大体相当于健康人吸入接触最高允许浓度的毒物时生物材料中被测物的水平。尿液可分为全日尿，晨尿，定时尿和随时尿。生物半减期：指进入生物体内的化学物质的里量通过各种途径消除一半所需要的时间，又代谢半减期。一、检验方法的一般要求：1.方法的一般要求1）灵敏度选择符合生物监测的基本要求2）操作简便3）试剂易得、价廉4）效率高5）符合国情，易推行、推广2．选择和建立生物检测方法必须考虑的因素：1）被测成分①溶解性，稳定性②含量水平高g/L水平低ug/L二、方法研制准则的基本内容1．取样、运输、保存的原则1）取样：（1）容器工具材质不干扰测定（2）取样的操作要防止污染（3）取样时间根据半减期判断决定（4）取样的体积尿液=50ml静脉血=5ml末梢血500ul2)保存时间：一天，三天，一周，两周一般只要求两周3）运输过程：保证分析物稳定，必要时要冷藏和冷冻运输4）防腐剂（尿）和抗凝剂（血）2.样品预处理原则1）尿液浓度按比重校正尿标准比重1.020，1.030及1.010的尿液应弃去2）样品预处理的目的是消除干扰（1）测定无机物时①用稀释液稀释后测定②混合酸消化（2）测定有机物成分：先水解，再分离（3）回收率=75%3.制定分析方法的程序1）分析条件选择、优化2）确定检出限（1）影响检出限的因素：试剂的纯度，仪器的工作状态，电源稳定性光源的温度变化、污染等不可控制的因素。（2）检出限的确定一般用统计法，一般用空白值的3倍标准差计算；色谱法用3倍噪音水平，检出限应小于0.3倍生物接触限值。（3）检出限的表示方法浓度或绝对量表示，用浓度表示时要说明方法取样体积。3）精密度：同一个人用同一方法重复测定同一均匀样品测定结果的符合程度通常在线性范围内取高、中、低三个浓度水平分别重复测定3~5次。用RSD表示或用变异系数表示复杂方法RSD=20简单方法=10.4)准确度（1）分析高低浓度水平和国家级标准物质各一组，测定值应在标准值的不确定范围内。（2）用接触表样品的加标回收率表示回收率=75%若105%表明存在明显的系统误差。（3）用标准方法或权威方法比较：①两个方法均值相对误差应小于10%②t检验在确定一个置信水平条件，两方法测定无明显差异5）干扰试验：如果有干扰，要找出消除干扰的方法6）样品的稳定性实验：时间：当天，3天，1周，2周温度：室温，普通冰箱冷藏（4℃），冷冻保存（-8℃），低温冰箱（-20℃）4.方法的验证1）新方法的验证：必须是另一单位①研制方提供方法所有技术材料②验证内容：四项线性范围，精密度，准确度，样品的稳定性。2）引进国外标准方法或权威方法，引进方就是验证方。5.现场应用①首先要观察检出率②观察检测结果与环境污染的符合程度③同时取非接触样品进行对照三、确定生物监测指标的依据（一）化学物质在体内的动力学过程1.吸收1）呼吸道吸收①气体物质通过肺泡壁及周围毛细血管吸收②固体物质，溶解时吸收的前提2）皮肤①有些有机物很容易被皮肤吸收F=C/15*(0.038-0.153p)exp(-0.016MN)F皮肤吸收量mg/㎝2/hC化学物质在水中的饱和度mg/mlP辛醇-水的分配系数MN相对分子质量②许多农药易被皮肤吸收如有机磷2.体内分压和贮存1）起始主要分布于血液中最终分布取决亲和力2）血液侧得量是反映新近吸收量或机体组织的水平3）血液中毒物或其他被测物并非均匀分布4）一般脂溶性溶剂及卤代烃会分布在脂肪组织中，乳汁是检测有机氯农药最好的样品5）体内储存毒物的形式大多为结合状态，测定尿液中的代谢物需要先水解3.生物转化1）概念：外源性化合物在体内经过一系列化学变化并形成其衍生物以及分解产物的过程。2）有关生物转化的讨论①是毒物发生质的变化②生物转化的数量关系，个体差异很大③是一种动态过程，对时间的了解是确定采样时间的基础，生物半衰期。4.排出易挥发性有机溶剂从呼吸气中排出较多。长期蓄积的有机氯农药可从乳汁中排出及叮咛中排出，易代谢的有机毒物大多以结合态从尿中排出。（二）、个体差异1、毒物在生物体内的动力学过程有种属家族和个体的差异，其中生物转化过程变异极大；2、生物监测的个体差异可用监测结果的变异系数表示；3、个体差异降低了生物监测的精确性，却可帮助检出特殊敏感人群或耐受人群。（三）、接触水平（剂量）—效应（反应）关系1、是确定一次生物监测指标的关键依据；2、生物监测结果与空气毒物浓度之间的相关资料，可作为选择生物监测指标的替代依据。四、检验指标的选择与分类（一）、选择的基本要求1、特异性好；2、具有良好的剂量—效应关系；3、稳定性好；4、有准确可靠的检验方法。（二）、生物材料检验指标的分类1、化学物质原形：①化学物质在生物体内不进行生物转化或转化速度很慢；②缺乏毒物代谢动力学资料；③代谢产物在体内没有特异性2、化学物质代谢产物3、生物效应指标。五、样品的采集与保存一）、生物材料样品的选择（一）、种类及特点尿液:最常用的1）特点：采集方便、无损伤性、采集量大2）适用性：水溶性化学物质、代谢产物、金属等3）尿样的种类：（1）全日尿（24h尿）收集24h内的全部尿液，通常只用于住院病人（2）晨尿起床后、早餐前第一次排出的尿（3）定时尿：生物半减期①班前尿：第2个工作日上班前以内排出的尿②班中尿：上班2~3h以后排出的尿③班末尿：下班前1h内排的尿④班后尿：下班以后1h以内排出的尿⑤周末尿：连续工作第五个工作日的班末尿。血液1）特点：①成分较恒定②个体差异小③取样污染机会小④损伤性采集样品⑤血样贮存条件要求较高；2）种类：①血清：不抗凝离心分离出的上层清夜②血浆：加抗凝剂离心分离的上层清夜③全血④红细胞。呼出气1）特点①优点：操作方便、干扰物少，非损伤性②缺点：a、被测物的含量比较低b、肺泡气中水分对某些测定有影响c、肺部“死腔”中环境空气对肺泡气稀释不稳定，影响测定结果的解释；2）适用性①监测仅限于挥发性物质②主要用于测定化学物质原形③呼出气监测结果能反映采样期间车间空气的平均浓度；3）呼出气的分类混合呼出气、终末呼出气（肺泡气）第一阶段呼出的是空气，第二阶段混合呼出气，第三阶段肺泡气。（二）、生物材料样品的选择1、同一毒物或代谢产物在不同生物材料其生物学意义不一样，血镉代表近期接触水平、尿镉反映长期接触的浓度；2、选择生物材料样品种类的要求：①被测物有特异性②与外剂量有相关性③有足够的稳定④测定结果重复性好，个体差异在允许范围内⑤采样能被受试者接受；3、尿、血、呼出气是目前较理想的生物材料样品，美国BEI55个尿58%、血27%、呼出气14%。二）、样品采集、运输及保存（一）、一般要求1、采样时间：依据生物半减期；2、采样环境：无污染；3、采样容器：①测无机成分、塑料、高压聚合玻璃：硬质、石英不锈钢含Cr、Ni、Mn（不能用于测此三种元素）使用前要求用酸液（稀HNO3）浸泡24h洗涤；②测有机物玻璃、塑料（不能用橡胶和添加染料的橡胶）冷冻保存不能用玻璃仪器；4、样品的运输与保存；5、采样记录①编号②检验项目③受试者信息④采样信息：时间、地点、环境、过程。⑤采样人及记录人信息（二）样品采集与保存1、尿样1）尿样的校正：(1)比重校正法标准比重1.020校正公式C校正=（1.020-1.000）/（d-1.000)*c=kcd的使用范围1.010～1.030(2)肌酐校正法.尿中被测物浓度（mg/g肌酐）=实测浓度（mg/L）/肌酐浓度（g/L），肌酐含量2)采样.采集尿液不少于50ml,用顶空分析法测定挥发性物质时.收集尿样的容器要充满尿样并知道体积，记录2人上次排光膀胱的时间及采集样的终点时间。3)储存.贮存一般2周.反腐加酸.氯仿.冷藏测尿中汞或挥发性有机物要尽快测定要保存5天以上的，最好冷冻2、血样1）采集（1）、全血；要抗凝（2）、血清（血浆）或红细胞2)注意事项采集过程避免污染.毛细管血防止溶血.金属针头（取下）再挤出针管时不能太快取末梢血要避免挤压采集部位，自然流出弃去第一滴血④有三种情况不宜采集毛细管血a血液量超过5ml.b采集环境有外源性化学物质存在c测定挥发性成分3)血样的运输与保存避免振动和温度的改变血样冷冻肯定溶血采集血清或血浆时，应分离再保存临时存放4℃过夜，长时间保存要冷冻④测酶活性要采集后尽快分析3.呼出气.1）采集方法：先深呼吸2~3次，再恢复正常呼吸时采集呼出气采集肺泡气只收集末端呼出气2）注意事项：受检者必须时肺功能正常者要选择对被测物吸附小的容器要在正常呼吸状态下收集样品呼出过程不能有阻力④采样的时机要依被测物代谢速度决定三、生物材料样品的预处理原则（一）无机物分析的样品处理1、稀释法.1）.常用的稀释剂;1)稀硝酸液（尿），2）TntonX—100表面活性剂3）基体改进剂溶液2）.常用机体改进剂：硝酸盐（NH4+Ni2+Ca2+）磷酸盐（Na+NH4+）3）.应用实例:磷酸铵，硝酸铵和TritonX-100可改善血清中铜锌的测定磷酸氢胺，硝酸铵测定血铅可提高灰化温度至1000℃硝酸镍可使测定砷和Se的灰化温度到1000℃④磷酸铵可使测定Cd的灰化温度增至800℃2、酸提取法1.硝酸提取，测定血铅.6mol/L硝酸离心取上清液。标准物质被测成分的含量是已知的2，盐酸提取3，三氯乙酸（固体）。铁（有效）提取+2价铁3、矿物化法（无机法处理）（二）有机物分析的样品处理（p11）第五节铅一、接触途径：铅矿，开采，冶炼二、代谢物和生物监测指标（一）动力学过程.1、吸收1）呼吸道：铅尘烟蒸汽2)消化道：铅尘3）皮肤，无机物不吸收有机铅化合物可被吸收（四乙基铅）2、分析：起始分布在血中有95%与红细胞结合最终主要以磷酸盐沉积于管中，其次是肝肾脑等3、生物效应：抑制血红蛋白的合成1）抑制5—氨基乙酰丙酸脱水酶，导致血尿中δ-ALA增加2）抑制粪川啉元氧化酶3）抑制亚铁螯合酶4、排除：吸收的铅主要经尿排出，尿铅生物半减期较长。（二）铅接触的生物监测指标1、血铅：直接反映近期接触铅的情况2、尿铅：反应机体中铅的负荷量，是铅中毒的辅助诊断指标3、生物效应指标：1）尿中σ—ALA2）血中铅原卟啉三、样品的采集与保存——用于尿铅血铅的测定1.尿样.①采样时间的限定②随即采集一次尿样③按1%比例加HNO3，4℃可保存两周。2.血样.1）末梢血40μL2）静脉血四、尿铅和血铅的测定——石墨炉原子吸收法（一）尿铅的测定1、原理：尿样用基体改进剂液稀释后直接进行测定，基体改进剂液NH4H2PO4+抗坏血酸2、石墨炉升温程序——适用涂铜石墨管①干燥~70℃,40S②灰化450℃,30S③原子化2000℃5S（停气）④清除2200℃3S3、石墨管涂钼处理，向石墨管中加20μL钼酸铵液，石墨炉升温程序①~③并重复10次升温，石墨管内壁呈灰白色4、标准系列液配置①铅标准系列液②基体改进剂液（混合液）③正常人混合尿：没有接触铅的健康人的尿，取2份，一份比重小于1.020，一份比重大于1.020，混合成比重为1.020的尿液5、说明：1）基体改进剂液的作用：本法选用4%磷酸二氢铵-6%抗坏血酸作为基体改进剂，能有效地克服基体干扰2）背景吸收的扣除①背景校正器扣除背景吸收，氘灯背景校正②石墨管涂钼可降低背景吸收（二）血铅的测定1、样品处理：全血用TritonX-100液稀释，稀HNO3酸化，进样测定2、石墨炉升温程序:①干燥：75℃-100℃,10S（斜坡升温）②灰化450℃-500℃30S保持10S（斜坡）③原子化2400℃7S④清除2500℃3S3、标准系列液：①铅标准液②TritonX-100液③正常人血五、生化指标的测定（一）尿中σ—AL