间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究

间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究免疫学杂志1999年第4期第15卷技术与方法作者：邓瑞春白云秀张明伟汪劲松黄英毛宁单位：军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所北京100850关键词：酶联免疫吸附测定粒细胞巨噬细胞集落刺激因子大肠杆菌摘要采用大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清，建立了间接ELISA方法经初步测定，该方法的灵敏度0．5ng／ml，比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色方法的灵敏度高3000倍，比银染色方法的灵敏度高150倍。在20～620ng／ml范围内测定呈直线关系，直线相关系为0.895。经8次重复测定，显示很好的重复性。可用于测定rhGM-CSF等基因工程产品中DH5α菌体蛋白的残余量。中图号R371-34DETERMINATIONOFTHEE．COLIDH5αPROTEINREMAINSINGENICENGINEERINGSEMI-FINISHEDPRODUCTGM-CSFDengRuichun，BaiYunxiu，ZhangMingwei，WangJinsong，HuangYing，MaoNing（ReadFour-RingInstituteofBiotechnology，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100850）AbstractTheantiserumwerepreparedagainstthetotalDH5αproteinbyimmunizingrabbits，andthenamethodwasestablishedtodeterminetheremnantsE．coliDH5αproteininthegeneengineeringsemi-finishedpro-ductofrhGM-CSF．Thesensitivityisabout0．5ng／ml，3000timeshigherthanthatofCoomasieBriliantBluestai-ningand150timesthanthatofsilverstainingofPAGE．Thelinearrangeofthemethodisbetween20-620ng／mlandthecorrelationcoefficient（r）is0．985，andrepeativityisgood．KeywordsEnzyme-likedimmunosorbentassay（ELISA），Recombinehumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor（rhGM-CSF），Escherichiacoli（E．coli）大肠杆菌DH5α是目原核细胞表达系统中，应用最普遍的基因工程菌之。人重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、人重组白细胞介素-2（rhIL-2）、人重组干扰素-α（rhIFN-α）等外源基因，都是在该宿主菌中获得高效转录和表达的。随着对基因工程产品在临床上的大量应用，对产品中宿主蛋白残余量的要求越来越严格。目前常用来鉴定残余蛋白的方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），毛细管电泳（CE），等电聚焦（IEF），HPLC（包括凝胶过滤，各种反相HPLC，离子色谱，疏水色谱等）。此外，还有一些化学法如观察末端是否均一等等。本文建立了间接ELISA方法，它简便、快速、灵敏、经济，是一种非常值得推广的方法。1材料和方法1.1材料大肠杆菌DH5α菌体蛋白，由本室培养制备；HRP-羊抗兔IgG，购自本院微生物流行病学研究所；Western印迹试剂盒，购自Sigma公司；卡介苗，购自北京生物制品所。BDSLImmunoskan340型酶联仪，英国；电泳仪，购自北京六一仪器厂。1.2方法1.2.1大肠杆菌DH5α培养及菌体蛋白的测定［3，4］：于LB培养基中培养大肠杆菌DH5α，经离心收集菌体，生理盐水洗2次，超声破碎，离心15000r／min10min，收集上清菌体蛋白，紫外分光光度法测定蛋白光吸收值，通过公式：mg／ml蛋白＝1．45×OD280－0．74×OD260计算含量，SDS-PAGE对DH5α菌体蛋白成分进行分析。1．2.2大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫：于免疫前1周，兔两侧腹股沟淋巴结注射卡介苗0．7mg，取4mg大肠杆菌DH5α菌体蛋白与1ml福氏完全佐剂混合，制成乳剂，于背部皮下多点免疫；2周后，注射不完全佐剂，免疫原剂量同前。随后，每隔2周加强1次，连续注射3次，最后1次自腹腔注射9mg抗原蛋白。7d后放血，收集血清，分装，于－20°C保存。1.2.3抗体效价测定：按文献［1］琼脂糖免疫双相扩散法。制备1％琼脂糖胶，铺板，打梅花孔。中心孔加1mg／ml菌体蛋白，周边孔加入倍比稀释的抗血清，放湿盒中，48h后观察结果。ELISA方法按文献［1］的方法。抗原包被量为4μg／ml，HRP-羊抗兔IgG的使用浓度为1000倍稀释，底物为邻苯二胺。1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳：按文献［3］进行。分离胶浓度8％，浓缩胶浓度5％。电极缓冲液25mmol／LTris-192mmol／L甘氨酸。1.2.5银染方法：将电泳胶用50％乙醇-12％醋酸固定20min，10％乙醇-5％醋酸洗3次，每次10min。取0．25％K2Cr2O7溶液浸泡7min，用去离子水洗2次，每次2min。将电泳胶浸泡于0．2％AgNO3溶液中，在20W日光灯下爆光20min，关灯放置20min，期间摇动若干次，至无色为止。无离子水洗3次，每次0.5min于摇动中加入0．28mol／LNa2CO3-0．05％甲醛，2～3次，视显色情况而定。1％醋酸定影10min，然后保存于去离子水中。1.2.6Western印迹实验：见参考文献［3］。电泳分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上，封闭膜上非特异性结合位点，加入兔抗大肠杆菌DH5α菌体蛋白血清，清洗后加酶标二抗，温育后清洗，用3.3′-二氨基联苯胺（DAB）染色。1.2.7免疫电泳：见参考文献［1］。1.2.8测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白的间接ELISA分析法：用0．05mol／LpH9．5碳酸盐缓冲液稀释的DH5α抗原溶液包被聚苯乙烯板，放4°C过液，次日用PBST洗涤3次，每次振荡3min。3％BSA-PBST封闭，37°C温育1h，同上洗涤。加入用1％BSA-PBST稀释的兔抗DH5α抗血清，37°C温育1h，同上洗涤。加1％BSA-PBST配制的HRP-羊抗兔IgG，37°C温育1h，同上洗涤。加底物液，避光反应20min，2mol／LH2SO4终止反应后，492nm测定吸光度。2结果与分析2.1抗血清效价测定用DH5α全菌蛋白作为抗原，免疫7只家兔，每只家兔免疫5次，所用抗原量分别为：4，4，4，10和9mg。用琼脂糖免疫双扩散法测定抗体效价。从表1可见，当免疫第3次（约定42d）时，抗体效价即可达1∶64倍，第4次时可达1∶128倍。但免疫到第5次时并未见效价继续升高。表1兔抗大肠杆菌DH5α菌体蛋白抗血清效价Tab1ThetiteroftheantiseraagainstthetotalDH5αproteins全屏显示表格AnimalnumberImmunodiffusionELISA（104）ThirdFourthFifth11∶641∶1281∶1281∶51221∶641∶1281∶1281∶51231∶641∶1281∶1281∶51241∶641∶1281∶1281∶51251∶161∶641∶641∶51261∶641∶1281∶641∶25671∶161∶321∶1281∶512表中还列出了ELISA法测定结果，即：除第6号家兔抗体效价稍低（1∶256×104）外，其余6只家兔抗体效价均达到1∶512×104。说明我们已经制备了高效价的抗血清。2.2抗体特异性测定图1为琼脂糖免疫电泳结果。7只家兔抗血清与抗原之间都能产生沉淀线，但不同个体所产生的沉淀线深浅度并不一样，这说明不同个体对不同抗原的免疫反应强度不同。该结果提示：在将抗体作为免疫诊断试剂使用时，应使用混合血清的抗体，这对保证所建方法有好的重复性，具有十分重要的意义。图1琼脂糖免疫电泳Fig1Agroseimmunoelectrophoresis①～⑦antiseraofrabbitstoE．coliDH5αproteinsrespectively；⑧Themixtureofthesevenrabbitsantisera；⑨ThetotalDH5αproteins图2为DH5α菌体蛋白与抗体间的免疫印迹反应。首先，本实验免疫的7只家兔的抗血清，与抗原蛋白之间都能产生免疫印迹条带，说明每种抗原都已刺激机体产生了相应的抗体。换句话说，我们制备的抗体，能与任何DH5α抗原反应。但与GM-CSF之间没有免疫印迹条带出现。说明这些抗体不与GM-CSF反应。可见，我们制备的抗体，不仅效价高，而且特异性好，它能特异地与GM-CSF等基因工程产品的宿主蛋白反应，但不能与这些基因工程产物反应。2．3方法的灵敏度、重复性和标准曲线用间接ELISA方法测定该方法的灵敏度，结果见表2。从表2可见，当抗体稀释5×104倍时，可测抗原浓度为0.5ng／ml。显示该方法具有较好的灵敏度，实验共重复8次，说明该方法具有很好的重复性。图2DH5α与抗体间的免疫印迹反应Fig2ThewesternblotbetweanDH5αandantisera（1）～（7）antiseraofrabbitstoE．coliDH5αproteinsrespectivily；（8）Themixtureofthesevenrabbitsantisera；（9）Nor-malrabbitsserum；（10）、（12）GM-CSF；（11）Marker表2ELISA法测定DH5α菌体蛋白的灵敏度、重复性（抗体稀释5×104）Tab2ThesensitivityandrespectivityoftheELISAmethod（Theantibodyisdiluted5×104）全屏显示表格Concentrationofantigen（ng／ml）A492nm（100003．027±0．08133002．739±0．09911002．197±0．1633701．235±0．0851200．519±0．079400．182±0．037140．065±0．02150．027±0．0101．50．016±0．0040．50．008±0．0040．170．007±0．007Ctrl0．001±0．0062．4ELISA法测定DH5α的标准曲线从图3可见，在20ng／ml到620ng／ml范围内呈直线关系，直线回归系0.985，说明在此直线范围内，测定的结果比较接近2．5与PAGE方法比较将DH5α蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，进行考马斯亮兰染色和银染，者最小检测值为1500ng／ml，后者最小检测值为75ng／ml。两方法检测灵敏度分别低于本实验建立的ELISA方法（0．5ng／ml）3000倍和150倍。进步说明本实验建立的方法具有较好的灵敏度。适合于基因工程产品中残余蛋白的检测。图3间接ELISA法动力学曲线Fig3ThekineticcurveofindirectELISA3讨论肠杆菌DH5α在基因工程产品中的残余量，直接影响到产品的质量。快速准确地测定DH5α的残余量，对产品的质量控制具有重要意义，其检测方法尚在不断改进和完善。目前常用的SDS-PAGE法灵敏度较低，且操作繁琐，耗时较长。毛细管电泳和高效液相色谱法虽然灵敏度较高，但需昂贵仪器，非一般实验室所能接受。本文建立的间接ELISA方法，通过对DH5α蛋白及rhGM-CSF样品进行初步测量显示：它的灵敏度很高，可测定0．5ng／ml菌体蛋白量，比现在常用的聚丙烯酰胺的考马斯亮兰染色方法的灵敏度高3000倍，比银染色方法灵敏度高150倍。标准曲线范围在20～620ng／ml，直线回归系数为