过氧化氢酶CAT活性测定

过氧化氢酶活性测定------------紫外吸收法过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。一、原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与设备与试剂】1、材料小麦叶片等。2、仪器设备研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；3、试剂0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。【方法】1.酶液提取：藻液接种后每隔1d，取40ml藻液（取时需摇匀），于4℃，于8500r/min（10000g）下离心10min收集藻体，用0.1mol/L、pH7.8磷酸钠缓冲液3mL重悬浮，然后用冰浴超声破碎细胞，破碎液在4℃下10200r/min离心10min,上清液即为SOD和CAT粗酶液。2.酶活性测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。表2-14-1紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号S1S2S3管号S0S1S2粗酶液(ml)0.20.20.2蒸馏水/ml1.01.01.0pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算：以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。过氧化氢酶活性U/(g.min)=WtVVAST1.0240A240=AS0－2)(21SSAA式中AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1,AS2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。【注】所用H2O2溶液及KMnO4一溶液临用前需重新标定。【注意事项】凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。