还原糖含量测定条件探究

还原糖含量测定条件探究生命科学学院2015/5/5还原糖含量测定条件探究【摘要】比较了两种DNS试剂测定还原糖含量的影响因素。探讨了试剂添加量、显色时间、测定波长以及显色后存放时间对测量结果的影响。结果表明，DNS试剂的用量1.5ml，沸水浴显色时间5min，显色定容30min后，分别在540nm波长条件下测定，数据的准确性和稳定性较好。【关键字】DNS（3,5-二硝基水杨酸）还原糖比色法测量条件目前，测定还原糖含量的方法很多，3,3-二硝基水杨酸（DNS）比色法是还原糖含量测定的一种常用方法。其具有简便、快速、灵敏度高等特点，但不同资料介绍的条件有很多差异，影响了测定结果的准确性和可比性[1-5]。本文对DNS比色法测定条件进行探究，讨论影响测量的关键因素，使测量结果更具有准确性和可比性，为实际采用该方法提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、苯酚、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、醋酸钠、冰乙酸，以上药品为分析纯。1.2实验仪器SP-721E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；Acculab精密电子天平；702-型电热鼓风箱大连干燥箱厂；DZF-6050型真空干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂；THZ-82A水浴恒温振荡器江苏荣华仪器制造有限公司；80-2离心机上海浦东物理光学仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司。1.3实验方法1.3.1DNS试剂配制称取3.25g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入500ml容量瓶，加2mol/L氢氧化钠溶液162.5ml，再加入22.5g丙三醇，摇匀，定容至500ml，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用[3]。称取2.5g3,5一二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0.5g苯酚，再溶解0.075g亚硫酸钠、2.5g氢氧化钠和50g酒石酸钾钠，移入500m1容量瓶，摇匀，定容至500m1，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。储存七天后使用[4]。1.3.2葡萄糖标准溶液的配置称取大于1g的葡萄糖置于热风干燥箱98℃干燥至恒重，准确称取1.000g葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。分别按表1进行配置操作，充分混匀后于沸水浴中加热煮沸5min。流水冲冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水4ml，混匀。以管1为空白对照，540nm波长下测各管的吸光度。绘制吸光度-葡萄糖浓度曲线。表1葡萄糖标准溶液配置管号1234561mg/ml葡萄糖溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20DNS试剂2.02.02.02.02.02.01.3.3DNS测定波长的确定取1.0ml葡萄糖标准液及1.0ml蒸馏水分别置于10ml试管中，再各加1.5mlDNS试剂，沸水浴加热5min，流水冷却，蒸馏水定容。将葡萄糖显色液-水(空白)、DNS试剂-水(空白)、葡萄糖显色液-DNS试剂(空白)分别在波长450～600nm范围内进行扫描。1.3.4DNS试剂用量及放置时间的确定在准确加入1.0ml葡萄糖标准溶液的系列10ml试管中，分别加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml的DNS试剂，沸水浴加热5min，流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，波长540nm下测定不同时间的吸光度。1.3.5加热时间的确定取葡萄糖标准液1ml及蒸馏水1ml于系列10ml试管中，分别加入DNS试剂，置沸水浴中加热、反应1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30min取出，流水冷却，定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，在波长540nm下测不同加热时间时溶液的吸光度。1.3.6精密度实验取5支管分别加入0.5ml葡萄糖标准溶液和1.5mlDNS试剂，混匀并作空白，沸水浴加热5min，流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，波长540nm下测定吸光度。2结果与分析2.1绘制吸光度-葡萄糖浓度曲线。结果如图1所示：0.00.20.40.60.81.00.00.20.40.60.81.01.2(1)(2)ODmg/mlModelPolynomiAdj.R-Squa0.996780.9994ValueStandardErD1Intercept-0.0020.00485D1B10.31470.008BIntercept-0.0080.00756BB11.1740.01249图1、540nm波长下葡萄糖的标准曲线2.2DNS测定波长的确定DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。关于DNS测量还原糖含量的波长，不同文献有不同的记载：分别有482-484、490、520、540等[6-9]。为了进一步探究其测量的最适波长，考虑相关因素进行波谱扫描，结果如图2所示：440460480500520540560580600620-0.20.00.20.40.60.81.01.21.41.61.8ODG+HH+DG+DDNS试剂1的波长扫描2.3DNS加热时间的确定随着沸水浴加热时间的延长，吸光度变大，但两种试剂均在5min之后吸光度基本不变，说明显色反应基本完成，吸光度较稳定。故DNS试剂水浴加热时间在5min即可，结果如图3所示：02468101214160.20.30.40.50.60.70.8ODTime(2)(1)图3、DNS试剂加热时间对测定结果的影响2.4DNS试剂用量及放置时间的确定DNS试剂的用量与加热后放置的时间长短对测量结果也会造成一定的影响，本文通过改变试剂用量和加热后放置时间，来确定最适宜的试剂用量与放置时间，如图4与图5所示：510152025300.320.340.360.380.400.420.44ODTime(0.5)(1.0)(1.5)(2.0)(2.5)(3.0)图4、试剂1放置时间及用量对吸光度的影响510152025300.300.350.400.450.500.55ODTime(0.5)(1.0)(1.5)(2.0)(2.5)(3.0)图5、试剂2放置时间及用量对吸光度的影响2.5精密度实验表2、试剂1精密度实验管号12345吸光度0.1570.1580.1570.1560.156平均值：0.1568标准差0.000837表3、试剂2精密度实验管号12345吸光度0.5600.6000.5300.5700.550平均值：0.562标准差：0.0258843讨论在实验过程中，显色之前空白和待测液中DNS试剂的添加量是相同的，但显色期间由于部分DNS试剂与待测液中还原糖相结合，从而造成测定吸光度时，空白中DNS试剂含量大于待测液中DNS试剂含量。从图1可知，最大吸收峰处的波长为500nm。一般情况下，选取最大吸收峰处的波长进行测定可以提高灵敏度，但由图1可知，在此波长下DNS试剂也具有一定的吸光度(DNS试剂-水曲线)。再者，实验过程中，显色之前空白和待测液中DNS试剂的添加量是相同的，但显色期间由于部分DNS试剂与待测液中还原糖相结合，从而造成测定吸光度时，空白中DNS试剂含量大于待测液中DNS试剂含量。故500nm下，DNS试剂对测定结果干扰严重。结合葡萄糖显色液-水曲线可以看出，这种影响在λ＜540nm的情况下一直很显著。故本实验DNS试剂1最终确定的测定波长选为540nm，而不是500nm(最大吸收波长)。两种DNS试剂基本都是在加热五分钟后，反应基本完成，吸光度比较稳定，故为了提高实验效率，我们在实验中可采取加热五分钟进行实验。由图4、5可知，试剂用量和放置时间与吸光度值的关系，当DNS试剂用量小于1.5ml时，溶液吸光度随DNS试剂用量的增加而增大，试剂用量在1.5～2ml时，放置20min后试剂2的吸光度值较稳定，而试剂一的吸光度则呈现先减小后增大的趋势。造成该现象的原因，可能是冷却时间不够，造成显色不够稳定。在实际测定中，两种试剂均可以采用1.5ml，建议试剂1的显色时间为30min而试剂2的显色时间为30min。从精密度实验来看，在本实验条件下试剂1的精密度大于试剂2。4.结论在碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸被还原糖还原生成的氨基化合物在500nm波长下具有最大吸收。但在此波长下DNS试剂具有一定的吸光度，对测定结果干扰严重，故DNS法测定还原糖含量最佳条件为DNS试剂用量1.5-2ml、沸水浴中保持5min、定容后放置30min后测量，检测波长为540nm。【参考文献】：[1]杨贵明，蒋爱华，薛秋生.用DNS光度法测定还原糖的条件研究[J]安徽农业科学2006，34（14）：3258-3264[2]陈齐英，孙雪奇，徐晓霞.3，5-二硝基水杨酸比色法测定亮菌口服液中多糖的含量[J].华西药学杂志，2000，1（53）：193-194.[3]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,1998.[4]中华人民共和国商业标准SB/T10077—92挂面生产工艺技术规程[5]郑远斌,吴锦忠.DNS比色法测定莲子中多种糖的含量[J].福建中医学院学报,2004，14（4）：32-35.[6]宋占午，王莱，刘艳玲.3,5-二硝基水杨酸测定还原糖含量的条件探讨[J].西北师范大学学报（自然版）1997，33（2）：52-54[7]孙伟伟,曹维强,王静.DNS法测定玉米秸秆中总糖[J].食品研究与开发，2006（6）：120-124[8]王俊丽,聂国兴,李素贞等，DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定[J]河南农业科学，2010（4）：115-118[9]赵凯，许鹏举，谷广烨.3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究[J]食品科学，2008（08）：534-536【附】马铃薯中还原糖含量测定实验报告马铃薯中还原糖含量测定实验报告实验原理：在氢氧化钠和丙三醇存在下，DNS与还原糖共热后被生成氨基化合物。再过量的氢氧化钠碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收值，在一定的浓度范围内，还原糖的量与吸光值呈线性关系，利用比色法可测样品中的含糖量。实验材料：马铃薯块药品：葡萄糖（需98℃烘干至恒重）3,5一二硝基水杨酸、苯酚、亚硫酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠仪器：离心机、10ml离心管、水浴锅、大号研钵、分光光度计、容量瓶、烘箱实验方法：样品的处理：马铃薯去皮，称5g加水10ml捣碎，倒入烧杯，50℃水浴加热20min，边加热边震荡，12000r/min离心十分钟，取上清液。（崔辉梅，马铃薯含量测定方法的比较2006）DNS配制：称取2.5g3,5一二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0.5g苯酚，再溶解0.075g亚硫酸钠、2.5g氢氧化钠和50g酒石酸钾钠，移入500m1容量瓶，摇匀，定容至500m1，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。储存七天后使用（中华人民共和国商业标准SB/T10077-92）葡萄糖标准溶液的配制：称取大于1g的葡萄糖置于热风干燥箱98℃干燥至恒重，准确称取1.000g葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至1000m1。分别按表1进行配置操作，充分混匀后于沸水浴中加热煮沸5min。流水冲冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水4ml,混匀。以管1为空白对照，540nm波长下测各管的吸光度。绘制吸光度一葡萄糖浓度曲线。管号1234561mg/ml葡萄糖溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20DNS试剂2.02.02.02.02.02.0实验步骤：分别取样液0.5ml于10ml试管，加入1.5mlDNS试剂，沸水浴加热5min，冷却后用蒸馏水定容至6ml，在540nm条件下，分光光度计测定OD值。实验结果：葡萄糖标准曲线0.00.20.40.60.81.0-0.050.000.050.100.150.200.250.300.35ODmg/mlEquationy=a+b*xAdj.R-Squ0.99678ValueStandardErC1Inter