赛来昔布对瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响及β-cateninC-myc表达的作用2

赛来昔布对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响及β-catenin和C-myc表达的作用宋凡伟1，朱世泽2，王朝阳，吴文艺，王韶华，李永峰，郑志芳【摘要】目的：探讨赛来昔布对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响及β-catenin和C-myc表达的作用方法:用不同浓度（0umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L、125umol/L）及不同作用时间（24h、48h、72h）的赛来昔布作用于人瘢痕疙瘩成纤维细胞，CCK-8法检测人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性，QRT-PCR、Western-blott检测体外培养的人正常皮肤及瘢痕疙瘩成纤维细胞中β-catenin和C-myc的mRNA及蛋白表达。结果:CCK-8法显示赛来昔布可显著抑制体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖（P0.O5），呈剂量和时间依赖性；QRT-PCR和Westernblot显示，体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞中，C-myc及β-catenin蛋白的表达明显高于人正常皮肤成纤维细胞（P0.05），而β-cateninmRNA表达无显著差异,随着赛来昔布药物浓度的增加，在体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞中，β-catenin和C-myc蛋白及mRNA的表达逐渐降低，各组之间差别具有统计学意义（P0.05）。结论：赛来昔布可能通过Wnt信号通路抑制体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，Wnt信号通路的异常是人瘢痕疙瘩发生的重要机制。【关键词】瘢痕疙瘩赛来昔布成纤维细胞细胞增殖TheeffectofCelecoxibonproliferationofHumanKeloidsFibroblastsandtheexpressionofβ-cateninandinC-mycvitro【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofCelecoxibonproliferationofHumanKeloidsFibroblastsandtheexpressionofβ-cateninandC-mycinvitro,tofurtherexplorethemechanismofit.MethodsWithdifferentconcentrations(0umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L、125umol/L)andeffecttime(24h、48h、72h)ofCelecoxibonculturedkeloidfibroblasts,andCCK-8assaywasadoptedtoevaluatecellsurvival，QRT-PCRandWesternblotwereperformedtodetecttheexpressionofβ-cateninandC-mycbeforeandafterinterventioninculturedkeloidfibroblasts,culturednormalfibroblasts.ResultCCK-8assayexibittedthatCelecoxibcouldsignificantlyinhibittheproliferationandactivityofHumankeloidfibroblastswithdifferentconcentrations(0umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L、125umol/L)andeffecttime(24h、48h、72h)(p0.05).RT-PCRandwesternblotresultsshowedthatthegeneandproteinexpressionofC-mycwiththeproteinexpressionofβ-catenininculturedkeloidfibroblastsweremuchhigherthanwhichinculturednormalfibroblasts（P0.05），withnothenodifferenceofmRNAlevelofβ-catenin（P0.05）；themRNAandproteinlevelofβ-cateninandC-mycwerealldecreasedin(0umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L、125umol/L)Celecoxibconcentrationbeforeandafterintervention,thereweresignificantdifferencesbetweenthesegroups(P0.05).ConclusionsCelecoxibcouldinhibittheproliferationofHumanKeloidsFibroblastscorrelatedwithitseffectonWntsignalingpathway,Wntsignalingpathwayabnormalitiesisanimportantmechanismfortheoccurrenceofhumankeloid.1福建医科大学附属第二临床医院2通讯作者，Email:[e-mail],福建医科大学附属第二临床医院，泉州医学高等专科学校【Keywords】KeloidsCelecoxibFibroblastsCellproliferation瘢痕疙瘩是皮肤创伤修复过程中的过度愈合，以胶原等细胞外基质过度沉积、成纤维细胞过度增殖为特征的皮肤纤维化疾病。目前瘢痕疙瘩的发生机制仍未明确，无根治特效药物，手术切除易复发。β-catenin是Wnt信号通路的关键因子，在皮肤创面的愈合及成纤维细胞过度增殖的过程中起重要作用【1】。原癌基因c—myc在瘢痕疙瘩组织中过度表达，与瘢痕疙瘩的发生也密切相关【2】。赛来昔布是一种非甾体类抗炎药，能高度选择性的抑制cox-2,而不影响cox-1的功能。赛来昔布还能通过非抑制cox-2途径拮抗肿瘤细胞增殖的作用。本实验探讨赛来昔布对体外培养的瘢痕疙瘩的作用机制，分析体外培养的人正常皮肤成纤维与瘢痕疙瘩成纤维细胞中β-catenin和C-myc表达的差异，为临床应用赛来昔布治疗瘢痕疙瘩提供依据；揭示瘢痕疙瘩发生发展的机制。1材料与方法1.1主要仪器超净工作台（江苏苏净集团安泰公司），倒置显微镜（OLYMPUS公司），二氧化碳培养箱（Forma公司），超低温冰箱（日本SANYO公司），台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂），垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司），转移电泳槽（美国Bio-Rad公司），全自动凝胶成相系统（美国VUP公司）等。1.2主要试剂赛来昔布（美国Selleck公司），DMEM-F12培养基（GIBCO公司），新生牛血清（PAA公司），青链霉素原液（GIBCO公司），CellCountingKit-8（碧云天公司），Trizol试剂盒（Invitrogen）,QuantcDNA第一链合成试剂盒（天根生物），引物合成（上海鼎安），SYBRGreenPCRMasterMix（TOYOBO公司），兔抗人β-catenin多克隆抗体、兔抗人C-myc多克隆抗体（武汉博士德公司），山羊抗兔IgG(北京中杉公司)，Beta-actin抗体（SantaCruz公司）。1.3瘢痕疙瘩成纤维细胞培养组块培养法行瘢痕疙瘩成纤维细胞原代培养，将瘢痕疙瘩切块去除表皮及皮下脂肪等，剪成0.5-1mm3的小块于一次性培养瓶中，置于培养箱中（95%空气,5%CO2,饱和湿度，37℃）培养6-8h使细胞贴壁，加入DMEM培养液（100ug/ml青、链霉素、DMEM、20%新生牛血清）继续培养，每周换液两次，原代细胞生长成单层后，每4～5天分种传代1次。1.4CCK-8法检测细胞增殖取对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞，用胰酶消化、离心后制成细胞浓度为5×104/ml悬浊液，取200μl接种于96孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁后，倒掉培养液。设立空白组（孔内只有DMEM培养液）、对照组（干预细胞的药物浓度为0umol/L）、实验组（25umol/L、50umol/L、100umol/L、125umol/L），每组分别设5个复孔，置于培养箱中继续培养（24h、48h、72h），每孔加入20uLCCK-8试剂，继续培养（0.5-4h）,在酶标仪450nm处检测培养24h、48h、72h各孔吸光度的A值，实验重复3次。1.5QRT-PCR检测β-catenin和C-myc表达取对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞分别加入药物（0umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L、125umol/L）作用48h，用Trizol分别提取瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞的总RNA，将提取的总RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板行荧光定PCR检测，采用20ul反应体系，反应条件95℃5min（95℃15s，60℃15s，72℃32s）40个循环。β-catenin的引物如下F:5’AAGCTTCCAGACACGCTA，R:5’CCAGTAAGCCCTCACGATG，C-myc的引物如下F:5’ACACATCAGCACAACTACGC,R:5,CCTCTTGACATTCTCCTCGGT,内参GAPDH-F：5’GGGAACTGTGGCGTGAT，GAPDH-R：5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA。结果采用IQ5软件行CT值相对定量分析，以GAPDH为内参，每个样品基因重复3管。1.6Western-blott检测β-catenin和C-myc表达取对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞分别加入药物（0umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L、125umol/L）作用48h，收集正常皮肤成纤维细胞及各组瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入裂解液裂解细胞收集总蛋白，BCA试剂盒蛋白定量检测，取适量蛋白上样，以聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，完毕后半干法电转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉TBST缓冲液封闭,与待测目的蛋白特异性抗体孵育杂交,曝光,显影,定影。用凝胶成像分析系统采集蛋白电泳条带凝，分析其吸光度，以目的蛋白的吸光度值与内参比值代表目的蛋白的半定量值。1.7统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，实验数据以x±s表示，以P0.05为差异显著，P0.01为差异非常显著。2.0结果2.1细胞增殖不同浓度的赛来昔布对体外培养的病理性瘢痕成纤维细胞均有抑制作用。在一定的时间内，随着药物浓度的增加，抑制作用明显增强；同一药物浓度下，随着作用时间的延长，抑制作用也增强,总体趋势显示有明显的浓度和时间依赖性。表（1）CCK-8法检测Celecoxib对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制作用Table1TheinhibitoryeffectofCelecoxibtreatmentonHumanKeloidFibroblastscellasassessedbyCCK-8test.Groupμmol/LA(450nm)InhibitoryRate(%)24h48h72h24h48h72h0(control)0.511±0.0120.700±0.0310.686±0.024——————250.487±0.010*0.624±0.017**0.525±0.029*4.810.923.5500.469±0.09*0.569±0.024**0.479±0.031*8.318.7130.21000.450±0.019*0.429±0.037**0.404±0.027**1238.741.11250.418±0.018*0.354±0.030**0.317±0.010**18.249.453.8*P0.05contrastwithcontrol,**P0.01contrastwithcontrol2.2C-myc和β-cateninmRNA水平的表达C-myc的mRNA在未加药瘢痕疙瘩成纤维细胞内的表达高