超干燥技术对福建柏种子活力的影响

超干燥技术对福建柏种子活力的影响1实验材料：当年采集福建柏种子、贮藏一年的福建柏种子2实验目的与猜想：2.1不同脱水方法对福建柏种子的影响：通过设置不同脱水方法，分别测定、福建柏种子各含水率水平的发芽力与活力、脱氢酶活性、a-淀粉酶、呼吸强度等相关指标的影响，以期确定一种最适合其超干贮藏的脱水办法，为福建柏种子更好的贮藏、延长其贮藏寿命提供依据。2.2种子脱水对破除种子休眠的影响：基础实验发现，经贮藏一段时间的福建柏种子的萌发率较新采集的福建柏种子要高20%（当年的发芽率30%左右，贮藏一年的50%左右），且经人工适度脱水后的福建柏种子的萌发率也有所提高。猜想：福建柏种子是否存在一种休眠机制，而自然脱水或人工脱水在破除种子休眠方面可以起到一定的作用？通过测定福建柏种子人工脱水处理过程中内源ABA、GA、MDA含量变化，拟合为与种子含水量相关的曲线，得出种子脱水与休眠的关系，为破除种子休眠提供相关依据。2.3福建柏种子的耐脱水机理研究：在脱水过程中会对福建柏种子造成损伤，种子通过自身的耐脱水机理可以在一定程度上避免损伤，从而保持活性。查阅大量文献猜想可能通过对①非还原糖的积累，以维持干燥条件下膜和蛋白质的稳定性，促进细胞质中玻璃化的形成；②在脱水过程中防止、忍耐或修复自由基攻击的能力；③被ABA诱导的保护性LEA蛋白。因此，可以通过测定福建柏不同含水量水平中非还原塘的组分变化情况、脱水蛋白（热稳定蛋白？可溶性蛋白？）的变化情况，推测可能有关的福建柏种子耐脱水机理。2.4福建柏种子超干燥超低温贮藏研究：大量试验证明植物细胞如果能耐受超低温保存前的脱水处理,就能在快速冷冻过程中存活。设计实验在超干燥处理的前提下，再进行快速冷冻处理。3实验方法：3.1不同脱水方法对福建柏种子萌发及相关生理生化指标的影响3.1.1脱水方法：参照伍贤进等的方法稍加修改。脱水方式分为：硅胶脱水，将种子置于装有活化硅胶的干燥器中（放入50℃烘干箱？）分别脱水1、3、6、12、20；②氯化钠脱水，将种子置于RH75%（饱和氯化钠溶液）的密闭容器中分别脱水3、6、12、20、30h；③硝酸钾脱水，将种子置于RH90%（饱和硝酸钾溶液）的密闭容器中分别脱水5、12、20、30、42h。上述3种方式均在相同室温下进行。3.1.2种子含水率测定：根据国家标准GB2772-81《林木种子检验方法》有关规定进行。采用105℃烘干法测定。（根据脱水方法不同设置3个对照组，每个对照组分别设置从10%、9%……1%的十个不同含水率的基准水平）3.1.2种子发茅率及活力测定：种子发芽试验按(GB2772-81)《林木种子检验方法》有关规定进行。每日记录发芽种子数，最后计算种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。其中，：发芽指数，在时间t的发芽数，：至t时的发芽天数。其中，：活力指数，：平均芽长，：发芽指数。3.1.3电导率测定：在25℃下将林木种子浸泡8h测定电导率，再在沸水浴中煮15min冷却至25℃时测定其电导率，每个处理4个重复，电导率仪采用DS-11A型。3.1.4脱氢酶活性测定：采用TTC定量法。用45℃的温水自然冷却浸种24h，取胚4个重复，每个重复100粒种子，用0.2%的TTC溶液在35℃黑暗环境下染色4-6h，染色后，倾出TTC溶液，用蒸馏水冲洗胚2-3次，移入研钵加入少量分析纯石英砂和丙酮进行充分研磨，把研液转到10mL容量瓶中，用丙酮溶液冲洗干净，将冲洗液也转移到容量瓶中，并定容至10mL摇匀，将部分提取液倒入5mL离心管中，在3000r/min的离心机中离心7min，倾出上清液用721型分光光度计在490nm波长下测定光密度值，在标准曲线中查出还原态TTC值。3.1.5a-淀粉酶测定：用45℃的温水自然冷却浸种24h，取胚4个重复，每个重复100粒种子，把胚移入研钵中加入少量分析纯石英砂和5mL研磨缓冲液冲洗，转移到试管中，将提取液放在70℃恒温中加热20min，在4000r/min离心机中离心5min，倾出上清液，用研磨缓冲液定容至10mL，作为酶制剂，吸取1mL酶制剂放入试管中，加入1mL淀粉溶液和1mL反应缓冲液，摇匀放在37℃的恒温水浴中保温，经过0,5,10min，分别吸取0.3mL的反应混合液放入试管中，迅速加入1mL显色剂，加入3mL蒸馏水，充分摇匀，用721型分光光度计在620nm的波长下测其光密度值。其中，：时间t内的光密度变化值；：种子粒数；：每次试验样品混合液中含淀粉毫克数（0.3mL混合液含有0.1mL淀粉溶液，含淀粉0.1mg);：提取的酶制剂总体积(10mL)：：反应时间；：每次测定用酶制剂体积(0.3mL混合液含有0.1mL酶制剂)。3.1.6呼吸强度测定：呼吸强度的测定:种子发芽初期的呼吸强度随发芽时间逐渐增大到一定程度就稳定在一定水平，为了测定效果更好,一般使种子置床后在种子发芽高峰期时测定，本次试验采用GXH-305型便携式红外线分析器测定，每个处理4个重复,每个处理100粒种子。3.1.7MDA含量测定：丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法3.2.1ABA、GA的测定：采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测量ABA与GA，需要准备相应的药盒。3.3.1稳定蛋白的提取、SDS-PAGE电泳、脱水蛋白的Western-Blot检测（主要方法参考）：（一）《铁皮石斛类原球茎空气干燥法超低温保存中的脱水蛋白分析》1.热稳定蛋白的提取取016g左右的样品,在液氮中研磨成粉状,置于2mLEppendorf管中,然后加入1mL样品提取液〔50mmol/LTris-HCl(pH810),1mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,100Lg/mLPMSF〕,充分摇匀,6726g离心10min,将上清移入新的Eppendorf管,于100e水浴10min,冰浴至室温,6726g离心5min,将上清液以每管300LL分装,加入4倍体积预冷的丙酮,摇匀后于-20e静置30min,再以5381g离心5min,去上清液获蛋白质沉淀,用80%丙酮洗涤沉淀1次,敞开管口,使残余的丙酮完全挥发。将沉淀溶于40LL样品提取液(不含PMSF),于-20e冰箱中保存备用〔14〕。2.SDS-PAGE及脱水蛋白的Western-Blot检测热稳定蛋白在Min-iPROTEANÓcell(BioRad公司生产)电泳。浓缩胶浓度为4%,分离胶浓度为12%。每加样孔蛋白质上样量约为20Lg,上样前将一定量的样品与等体积2倍SDS凝胶上样缓冲液〔100mmol/LTris-HCl(pH618),200mmol/LDTT,4%SDS,012%溴酚蓝,20%甘油〕相混合。电泳后,凝胶用考马斯亮蓝R-250进行染色。SDS-PAGE结束后立刻转膜,用Min-iProteanIIElectrophoresis(美国BioRad公司生产)将蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF(德国Roche公司产品)上。脱水蛋白抗体(1B1000稀释)由美国加州大学的TimothyJ.Close教授赠送。用于蛋白质免疫检测的试剂盒购自晶美生物工程公司,为美国KPL实验室的ProteinDetectorTMWesternBlotKit〔HRP,LumiGLOSystem,Ant-iRabbitIgG(H+L)〕。用时HRP以1B1000倍稀释。（二）《春小麦种子脱水蛋白的检测及其积累动态》试剂兔抗脱水蛋白抗体为Stressgen公司产品,辣根过氧化物酶偶连的山羊抗兔IgG二抗购自北京中山生物技术有限公司。辣根过氧化物酶荧光底物检测试剂盒为Roche公司产品。低分子量蛋白质标准为上海丽珠公司产品。蛋白浓度测定试剂盒为Bio-Rad公司产品。其余试剂为国产或进口分析纯。实验方法1.种子抗热变性蛋白提取小麦种子抗热变性蛋白提取参照Werner-Fraczek等[5]的方法进行。单粒种子研碎后,加入500LL提取缓冲液(30mmol/LTES,50mmol/LNaCl,1mmol/LPMSF,pH7.5)在冰浴中充分匀浆,然后在14000r/min,4℃离心10min。取上清液继续在14000r/min,4℃离心10min,弃去沉淀,保留上清。将最终获得的上清液在沸水浴中加热10min后在冰上冷却,14000r/min,4℃离心10min,取上清液测定蛋白浓度并制备SDS-PAGE样品。2.SDS-PAGE和免疫印迹检测SDS-PAGE参照Laemmli[6]的方法,浓缩胶浓度为4%,分离胶浓度为12.5%。电泳结束后参照Towbin[7]的方法电转移到硝酸纤维膜上。转到膜上的蛋白条带经过丽春红染色检测转移效果后,在含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温下封闭1h或在4℃冰箱中过夜。之后经过少量TBST漂洗,在含有0.5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中和1∶2500工作浓度的一抗室温下孵育1.5h,将硝酸纤维素膜用TBST漂洗两次,每次10min。将经过一抗孵育并漂洗过的膜在1∶5000的二抗中进行孵育,除了将一抗换为二抗外,其余条件和一抗孵育时相同。二抗反应结束,用TB-ST漂洗三次,每次30min。最后用辣根过氧化物酶荧光底物检测试剂进行检测,用X光胶片曝光记录结果。3.小麦种子成熟过程中脱水蛋白积累动态分析开花期对大田种植的青春533同一天开花的麦穗进行标记,花后一周开始分期取样直至完全成熟。每次取穗中部籽粒,迅速投入液氮中带回室内,转到-75℃保存。同时取10穗中的籽粒测定含水量。在进行种子脱水蛋白检测中,将提取的种子总蛋白进行蛋白含量测定后,调整各样品到相同的蛋白含量,然后进行沸水浴处理后制备SDS-PAGE样品。SDS-PAGE和免疫印迹条件均同前述。（三）《干旱胁迫下外源ABA对观赏海棠叶片可溶性蛋白和脱水素积累的影响》中的方法1.可溶性蛋白(SPC)含量测定：参照Jiang等(2002)的方法，稍作改进，从叶片中提取总的可溶性蛋白。液氮法研磨叶片组织(0.5g鲜质量)至细粉状，并快速转移至干净的离心管中，加入1.5mL硼酸缓冲液(50mmol·L－1硼酸钠盐，50mmol·L－1抗坏血酸，1%β－巯基乙醇，1mmol·L－1苯甲基磺酰化氟(PMSF，pH9.0)，混匀后于4℃，13000r·min－1，离心1h，提取上清液。采用考马斯亮蓝法(张治安等，2004)测定蛋白质含量，取30μL蛋白样品与1.5mL考马斯亮蓝试剂短暂混合，2min后测定595nm处的吸光度值，以牛血清蛋白作为标准。2.SDS-PAGE和免疫印记杂交：参照Jiang等(2002)的方法。提取上述可溶性蛋白上清液继续在4℃下，13000r·min－1，离心15min，取上清液制备SDS-PAGE样品。取80μL蛋白样品加入20μL5×SDS上样缓冲液(65mmol·L－1Tris-HCl，10%甘油，2%SDS，pH6.8，1%溴酚蓝，5%β－巯基乙醇)，沸水浴3～5min，根据每管样品蛋白质浓度计算上样量体积，每孔上样30μg总蛋白。用5%的浓缩胶和16%的分离胶，进行SDS-PAGE分析，溴酚蓝染料前沿至凝胶末端处时停止电泳。切去浓缩胶，在分离胶上做好标记放入培养皿中，倒入少量考马斯蓝G-250显色液，在摇床上振荡2h，染色。倾去染色液，用脱色液(20%乙醇，70%冰醋酸)洗涤摇晃，期间要不断更换脱色液(4h一次)，直至凝胶背景清楚为止(12～18h)。用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝中心距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率∶相对迁移率=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)。以标准蛋白相对迁移率的对数为纵坐标，以标准蛋白分子量为横坐标作图，制作标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量。3.脱水素免疫印记杂交，将另一块同样处理但未经考马斯亮蓝染色的凝胶，200mA恒流，4℃过夜电转移至带0.45mm孔的硝酸纤维素膜上。印迹膜用丽春红S应用液染色2min后，并用PBS漂洗数次，在TBST缓冲液中，用3%的BSA室温封闭2h后