遗传多样性的分子检测.

第三章遗传多样性的分子检测遗传多样性（geneticdiversity）是生物多样性的重要组成部分，是生态系统多样性和物种多样性的基础，任何物种都有其独特的基因库或遗传组织形式。广义的遗传多样性是指地球上所有生物携带的遗传信息的总和，但通常所说的遗传多样性是指种内的遗传多样性，即种内不同种群之间或一个种群内不同个体的遗传变异。遗传多样性的概念遗传多样性的表现形式是多层次的，可以从形态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点及DNA序列等不同的方面来体现，其中DNA多样性是遗传多样性的本质。遗传多样性的表现层次对遗传多样性的系统研究始于十九世纪，达尔文在《物种起源》中用大量资料和证据揭示出生物中普遍存在的变异现象，并发现大部分变异有遗传现象，他把这种可遗传的变异称为多样性。随着孟德尔遗传定律的重新发现，摩尔根染色体遗传学及后来发展的细胞遗传学的诞生为群体遗传理论的发现奠定了基础并提供了科学的实验依据，充分证实了自然界中确实存在大量的遗传变异。遗传多样性的研究随着生物学理论和技术的不断进步，以及实验条件和方法的不断改进，检测遗传多样性的方法日益成熟和多样化，可以从不同的角度和层次来揭示物种的变异。遗传标记（geneticmarkers）的发展经历了形态学标记（morphologicalmarkers）、细胞学标记（cytologicalmarkers）、生物化学标记（biochemicalmarkers）和分子标记（molecularmarkers）4各阶段。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。形态学标记、细胞学标记和同工酶标记都是基因表达的结果，是对基因的间接反映，标记数目有限、多态性差。DNA分子标记是以个体间核苷酸序列差异为基础的遗传标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映，能更准确的揭示种、变种、品种、品系乃至无性系间的差异。DNA分子标记DNA标记的优越性①较高的可靠性，直接以DAN的形式表现，不受环境因素、取样部位和发育阶段的影响，不存在基因表达与否的问题；②数量多，遍及整个基因组；③多态性高，自然存在着许多变异；④表现为“中性”，不影响目的基因的表达，与不良性状无必然的连锁；⑤有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型与杂合基因型。根据依赖的技术手段的不同，DNA分子标记可分为3大类：第一类是以杂交技术为基础的分子标记，如限制性片段长度多态性（RFLP）标记、数目可变串联重复多态性（VNTR）标记；第二类是基于PCR技术为基础的分子标记，如随机扩增多态性DNA（RAPD）标记、任意RCP（AP-PCR）标记、DNA指纹（DAF）标记、序列特征化扩增区域（SCAR）标记、扩增片段长度多态性（AFLP）标记、简单重复序列（SSR）标记、内部简单重复序列（ISSR）标记等；第三类是基于测序和DAN芯片技术为基础的分子标记，如表达序列标签（EST）标记和单核苷酸多态性（SNP）标记等。理想的DNA分子标记应具备的特点①遗传多样性高②共显性遗传③在基因组中大量存在且分布均匀④表现为“中性”，对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁⑤稳定性、重现性高⑥信息量大，分析效率高⑦检测手段简单快捷，易于实现自动化⑧开发成本和使用成本低RFLP是最早发展的分子标记，用已知的限制性内切酶消化从生物体中提取的DNA，经过电泳、印迹、探针杂交，最后用放射自显影显色或发光分析显示与探针互补的DNA片段，因为每种限制酶只识别专一的碱基序列，DNA序列的变化就会导致酶切位点的减少或增加，限制性片段的长度发生变化从而显示多样性。限制性片段长度多态性（RFLP）标记RFLP标记特点：呈孟德尔遗传，不受环境影响；RFLP标记等位基因之间呈共显性；非等位的RFLP标记之间不存在上位效应及其它形式的基因互作；结果稳定可靠，重复性好。RFLP标记的缺点：分析程序复杂，技术难度大，费时，成本高，需要适合的探针和放射性同位素，而且每次反应需要的DNA量较大，多态性位点数目有限，所以应用受一定的限制。RAPD技术是由Williams和Welsh领导的两个小组同时提出的，Williams称之为RAPD，Welsh称之为AP-PCR。它是利用一个随机序列的寡核苷酸引物，通常为10个核苷酸，以基因组DNA作为模板进行PCR扩增反应，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。随机扩增多态性DNA（RAPD）标记RAPD优点：1)不需要了解研究对象基因组的任何序列，只需很少纯度不高的模板，就可以检测出大量的信息。2)无需专门设计反应引物，随机设计长度为8-10个碱基的核苷酸序列就可应用。3)操作简便，不涉及分子杂交、放射自显影等技术。4)需要很少的DNA样本。5)不受环境、发育、数量性状遗传等的影响，能够客观地提示供试材料之间DNA的差异。RAPD局限性：①它呈显性遗传标记（极少数共显性），不能有效区分杂合子和纯合子。②易受反应条件的影响，某些情况下，重复性较差，可靠性较低，对反应的微小变化十分敏感。如聚合酶的来源，DNA不同提取方法，Mg2+离子浓度等都需要严格控制。AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1-3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。扩增片段长度多态性（AFLP）标记AFLP分子标记的特点①DNA需要量少，检测效率高，理论上可产生无限多的AFLP标记。一个0.5mg的DNA样品可做4000个反应。由于AFLP分析可采用多种不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择性碱基，因此理论上AFLP可产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组。②多态性高。AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态分辨能力。AFLP分子标记的特点③可靠性好，重复性高。AFLP分析采用特定引物扩增，退火温度高，使假阳性降低，可靠性增高。AFLP标记在后代中的遗传和分离中遵守孟德尔定律；种群中的AFLP标记位点遵循Hardy-Weinberg平衡。④对DNA模板质量要求高，对其浓度变化不敏感。AFLP反应对模板浓度要求不高，在浓度相差1000倍的范围内仍可得到基本一致的结果。但该反应对模板DNA的质量要求较为严格，DNA的质量影响酶切、连接扩增反应的顺利进行。AFLP技术的应用：AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，在动物遗传育种、动物基因组研究中有着广泛的应用前景，如：①构建遗传连锁图谱；②利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记；③AFLP辅助的轮回选择育种；④利用AFLP技术研究基因表达与调控；⑤分类和进化研究；⑥甲基化研究，等。微卫星标记（microsatellite），又称为短串联重复序列(simpletandemrepeats,STRs)或简单重复序列（simplesequencerepeats），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星标记根据重复单元的构成与分布，微卫星被分为3类：①单纯（pure）SSR：指由单一的重复单元所组成的序列，如(AT)n；②复合（compound）SSR：是由2个或多个重复单元组成的序列，如(GT)n(AT)m；③间隔（interrupted）SSR：在重复序列中有其它核苷酸夹杂其中，如(GT)nGG(GT)m。微卫星标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。SSR标记优点：①一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；②微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；③所需DNA量少。缺点：①微卫星引物的通用性还不够高，一个物种的特异微卫星引物在别的物种中使用时要进行筛选，且多在较近缘的物种间利用，否则可信度会受影响；②微卫星引物较贵，成本较高。EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20到7000bp不等，平均长度为360±120bp。EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。表达序列标签（EST）标记EST构建的技术路线：①提取样品的总RNA或带有polyA的mRNA②构建cDNA文库，随机挑取大量克隆进行③EST测序④对测得的EST进行组装、拼接⑤对网上已有的EST数据库进行同源性比较⑥确定EST代表的是已知基因还是未知基因⑦对基因进行定位、结构、功能检测分析EST的应用：EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记(如AFLP、RAPD、SSR等)相比更可能穿越家系与种的限制，因此EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用。同样，对于一个DNA序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。EST作用具体表现在：①用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱；②作为探针用于放射性杂交；③用于定位克隆；④借以寻找新的基因；⑤作为分子标记；⑥用于研究生物群体多态性；⑦用于研究基因的功能；⑧有助于药物的开发、品种的改良；⑨促进基因芯片的发展等方面。SNP全称SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为1:2。SNP在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T,原因是CG中的C常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言,SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。单核苷酸多态性（SNP）标记在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(codingSNP，cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：①同义cSNP(synonymouscSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；②同义cSNP(non-synonymouscSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。SNP的特性①SNP数量多，分布广泛②SNP适于快速、规模化筛查③SNP等位基因的频率容易估计④易于基因分型SNP的检测技术一、基因芯片技术基因芯片技术：是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。优缺点：优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模性筛选，被捡起始材料也很少，操作步骤简单。缺点是芯片设计成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检测到。二、Taqman技术在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，他们分别与两个等位基因完全配对。探针运