遗传多样性的分子检测2015

备选实验三遗传多样性的分子检测DNA指纹技术【实验原理】“DNA指纹”是指利用DNA差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。DNA指纹是以DNA的多态性为基础，而卫星DNA的发现则是其最重要的奠基石。卫星DNA是由一短序列（即重复单位或核心序列）多次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列（variablenumbersoftandemreprat，VNTR）,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星DNA，重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星DNA的多态性则来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。例如，人类1号染色体上的VNTRD1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知有29种不同的等位基因。DNA指纹图谱的基本特点：多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。高变异性：DNA指纹图谱反应的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同DNA指纹图谱的概率仅为5×10-19，因此，除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的DNA指纹图谱完全相同。稳定的遗传性：DNA指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代DNA指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率（基因突变）仅在0.001～0.004之间。DNA指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA作出的DNA指纹图谱是一致的。本次实验所选择的方法是D1S80指纹图谱分析的常用方法。人群中D1S80座位的杂合率约为86％。从理论上讲，可能存在435种不同的等位基因组合。利用D1S80座位两侧序列设计的引物（Kasaietal，1990），通过PCR反应，很容易确定特定个体的D1S80等位基因构成，纯合体只有一条DNA带，而杂合体有两条不同的DNA带。【材料】人类口腔细胞。【仪器与试剂】1．仪器微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪（或凝胶成像仪）。枪头，1.5mL，0.2mL离心管，棉签，使用前均需121℃高温灭菌2．试剂NaCl，琼脂糖，溴化乙锭，Na2-EDTA，SDS，Tris，ProteinaseK，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA相对分子质量标记，Chelex100树脂（Bio-Rad），PCRpre-mix。3．溶液配制（1）5%Chelex树脂Chelex100(Bio-Rad)0.5g50mmol/LTris-HCl10mL用4mol/LNaOH调pH至11，室温可保存3个月，使用前充分混匀。（2）2.0％琼脂糖凝胶称2.0g琼脂糖放入250ml三角烧瓶，加入1×TAE溶液100mL微波炉加热溶解，冷却至60℃左右加入1μg/mL溴化乙锭（EB），缓慢混匀后倒胶板。（3）溴化乙锭（EB）用无菌水配制5mg/mL储藏液，工作浓度1μg/mL。注意；溴化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。（4）0.5mol/LEDTA(pH8.0)Na2-EDTA18.61gNaOH2g蒸馏水定容至100mL，室温保存。（5）10×TAE电泳缓冲液Tris48.4g冰醋酸11.42mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL蒸馏水定容至1000mL，室温保存。（6）10%SDSSDS10g用无菌水溶解后（可加热），定容至100mL，室温保存。（7）蛋白酶K溶液20mg/mL蛋白酶K水溶液5mL10%SDS1mL无菌水94mL冰箱冷藏。（8）无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。（9）1mol/LTris-HCl(pH8.0)将12.1gTris溶解在80mL蒸馏水中，加盐酸调节pH至8.0，加蒸馏水定容至100mL。4．引物Primer1：5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3’Primer2：5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3’【实验步骤】1．收集DNA样本（1）先漱口，然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入1.5mL装有1mL无菌水的小离心管中，使粘附在牙签表面的口腔细胞悬浮其中（以能看到悬浮物为好）。震荡10s，10000r/min离心1min。（2）从离心管中吸出970μL无菌水，注意不要吸到沉淀。（3）向离心管中加入200μL5%Chelex100，震荡10s混匀。（4）加入2μL蛋白酶K，混匀，56℃保温5min。（5）剧烈震荡10s,沸水浴8min。（6）10000r/min离心3min，离心管中溶液分成上下两层：下层为Chelex100和细胞碎片的沉淀，上层溶液含DNA分子，可以直接用作PCR模板。此DNA样本可在4℃或-20℃保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。2．PCR扩增D1S80等位基因（1）每个人用记号笔在0.2mLPCR管上做好标记。（2）准备冰盒，开始反应前尽量使PCR管保持在冰上。（3）依次加入下列成分，配制25μL体系的PCR反应溶液：PCRpre-mix12.5μL引物11μL引物21μL口腔细胞DNA样本10μL加无菌水至总体积25uL。（4）轻弹管壁，混匀溶液。（5）离心10s，使管壁上的液滴落下。（6）按下列程序开始PCR反应：94℃，1min94℃，15s68℃，15s30个循环72℃，15s72℃，10min4℃暂时放置，直至开始电泳3．PCR扩增产物鉴定与D1S80等位基因分析（1）用1×TAE电泳缓冲液配制2.0%琼脂糖电泳凝胶。（2）60V预电泳1～2min。（3）在凝胶上选一孔加入6µL的DNA相对分子质量标记（DNA100bpLadder）。（4）每位同学将各自的20µLD1S80PCR扩增产物加入指定凝胶样孔，注意不要有气泡进入。（5）60V电泳40min-50min。（6）取出凝胶用清水漂洗。（7）用紫外分析仪观察凝胶，记录每个个体的DNA条带数目及其位置。【思考题】用PCR、RFLP、RAPD方法产生DNA指纹图谱各有哪些利弊？