酪氨酸酶的提取及其催化活性研究

酪氨酸酶的提取及其催化活性研究一．实验目的认识生物体中酶的存在和催化作用，便学生了解生物体系中在酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性。掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。二．实验原理在实验室里，复杂的有机物合成与分解往往要求在高温、强酸、强碱、减压等剧烈条件下才能进行。而在生物体内，虽然条件温和（常温、常压和接近中性的溶液等），许多复杂的化学反应却进行的十分顺利和迅速，而且基本没有副产物，其根本原因就是由于生物催化剂———酶的存在。酶是具有催化作用的蛋白质。按照酶的组成，可将其分为两类:(1)简单蛋白质其活性仅决定于它的蛋白质结构。如脲酶、淀粉酶等；(2)结合蛋白质这种酶需要加入非蛋白质组分(称之为辅助因子)后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶，例如酪氨酸酶就是以Cu+或Cu2+为辅助因子的全酶。辅助因子虽然本身无催化作用，但参与氧化还原或起运载酰基载体的作用。若将全酶中的辅助因子除去，则酶的活性就失去了。酶参与的多巴转换反应通常把被酶作用的物质称为该酶的底物。一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起了广大分析工作者的兴趣。目前，酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是在生化、医学方面。例如一些生命物质和液体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。本实验拟通过从土豆中提取酪氨酸酶并测定其活性，使同学们对酶有个初步的了解。我们都见过，当土豆、苹果、香蕉、蘑菇受损伤时显棕色的现象，这是由于土豆、苹果等含有酪氨酸和酪氨酸酶。酶存在于物质内部，当内部物质暴露出来后，在空气中的氧参与下，发生了如图9-6-1所示的一系列反应，生成黑色素。酪氨酸酶可用比色法测定。由于多巴转变成多巴红速率很快，再转到下一步产物速率慢得多，故可在酶存在下，测定多巴转变为多巴红的速率而测定酶的活性。(可用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性)。酶的活性计算:一般定义在优化的条件下(pH、离子强度等),25℃时在lmin内转化lμmol底物所需要的量为酶的活性单位。通过下式可计算出所用的酶的活性：a=ktVA×106式中:a为所用溶液的酶的活性，△A为最大吸收处吸光度的变化，t为时间，k为多巴红的摩尔吸收系数，V为加入的酶体积。进而计算出所用原料中的酶的活性：maVAO/式中：A为原料中酶的活性，VO为原料所得的酶溶液的总体积，m为原料总质量。三．实验仪器与试剂1．仪器：分光光度计，离心机，研钵，水浴，秒表。2．试剂：二羟基苯丙胺酸(多巴)，磷酸氢二钠，盐酸，sephedex柱，材料:土豆(或苹果)。四．实验步骤1．溶液配制0.l0mol·L—1磷酸缓冲溶液(pH=7.2)：50mL0.20mol·L—1磷酸氢二钠+8mL0.lmol·L—1盐酸，稀释到200mL；0.l0mol·L—1磷酸缓冲溶液(pH=6.0)：50mL0.20mol磷酸氢二钠+22mL0.1mol·L—1盐酸，稀释到200mL；0.010mol·L—1多巴溶液，称取0.195g多巴，用pH=6.0的磷酸缓冲溶液溶解并稀释到100mL。2．酶的提取在研钵中放入l0g切碎了的土豆，加入7.5mLpH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压。用两层纱布滤出提取液，立即离心分离(约3000rpm,5min)。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中。提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。有条件的话，可以经sephedex柱进一步纯化。3．多巴红溶液的吸收光谱（选做）取0.4mL已稀释过的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的缓冲液。加2mL多巴溶液，摇匀。反应约l0min后，使用lcm比色池于扫描分光光度计上进行重复扫描，即可获得多巴红的吸收光谱。若使用自动扫描分光光度计，可从混合开始以时间间隔为lmin进行连续扫描，可以观察到吸光度随时间增加的现象。4．酶的活性测量取2.5mL上述提取液用pH=7.2的缓冲液稀释至l0mL比色管中，摇匀。取0.lmL稀释过的提取液于l0mL比色管中，加入2.9mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入2mL多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在480nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读1个数，以后隔2min读l个数，直至吸光度变化不大为止。取0.2mL,0.3mL,0.4mL已稀释过的提取液重复上述实验，[注意总体积为5mL，每次换溶液洗比色皿只能倒很少量溶液洗1次。以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。五．实验结果和讨论1．不同酶加入量的动力学曲线以吸光度值为纵坐标，时间为横坐标，可得出在加入酶的作用下多巴的转换动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即为酶的活性。依次得出不同提取液的活性，比较不同体积的提取液加入后相同量的多巴转换速率。2．酶的活性计算将不同体积提取液的实验结果填入下表，计算出原料中酶的活性。已稀释的提取液体积/mL活性/A·min—1原提取液活性（mL—1）原料活性/g—10.l00.200.300.403．影响酶的活性的因素研究（1）取0.40mL稀释过的提取液在沸水浴中加热5min，冷却后配成测定溶液，观察现象。（2）取0.40mL稀释过的提取液，加少量固体Na2S2O3配成测定溶液，观察现象。（3）取0.40mL稀释过的提取液，加少量固体Na2EDTA振动混合，反应一段时间后配成测定溶液，观察现象。六．实验说明若使用自动扫描分光光度计，可使用指定时间间隔扫描。但建议使用722型分光光度计或类似的型号，用秒表控制时间，这样成本较低。若没有扫描分光光度计，第3步可以忽略。也可以使用多巴红溶液直接获得其吸收光谱。可使用苹果或香蕉代替土豆，亦可安排使用不同土豆(如隔年、当年及新产，或已发芽等)，研究土豆不同生长状态时的酶活性。若有时间的话，亦可研究不同pH、离子强度对酶的活性的影响。七．思考题1．酶的活性受何种条件影响?2．提取物在放置过程中为何会变黑?3．经热处理后酶的活性为何显著降低?八．参考文献[l]KenllnerR,MermetJM,OttoMWindmerHM.AnalyticalChemistry.Chapter6.Weiheim:WileyVCH，1998;北京大学、吉林大学合译．分析化学．北京:北京大学出版社，2000．第6章[2]沈同，王镜岩编．生物化学上册．北京:高等教育出版社1990．第5章[3]StryerL编，唐有棋等译．生物化学．北京:北京大学出版社，1990[4]FrieclmanME,DaronHH.JChemEdu,1977,(54):256[5]叶率官．化学试剂，1981,(2);6