酶与蛋白质工程-刘

名词解释：1、一级结构：蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。是蛋白质最基本的结构，并由基因上遗传密码的排列顺序决定。2、二级结构：一段连续的肽单位借助于氢键，排列成的具有周期性结构的构象。包括α-螺旋、β-折叠、回折、环肽链、无规则卷曲等。是多肽链主链区域的规则结构，不涉及侧链构象和与多肽链其他部分的关系3、结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成2个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。4、α-螺旋两亲性：α-螺旋一侧主要分布着亲水（极性）氨基酸残基，而在另一侧主要集中疏水残基，所以具有两亲性。5、三级结构：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。是多肽链上所有原子包括主链和残基的侧链在三维空间中的分布6、分子伴侣：是一种引导蛋白质正确组装、折叠的蛋白，但不构成被介导蛋白质的组成7、第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着的对应关系称为第二遗传密码或折叠密码8、同源蛋白质：在不同生物体中具有相同或相似功能的蛋白质称为同源蛋白质9、蛋白质分子设计：为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案10、Scaffold设计：即框架设计，是指对蛋白质分子的立体设计11、定点突变：一般是知道要突变位点的情况下，应用PCR方法通过引物将突变引入DNA分子从而改变氨基酸序列。12、定向进化：采用随机的基因突变或基因重组技术与定向的突变体筛选方法相结合的分子进化技术。13、内含肽：在蛋白质成熟过程中被剪切掉的一段框内融合于前体蛋白的氨基酸序列。14、融合蛋白标签：用于重组蛋白质的纯化，目的蛋白质的检测和定向固定等应用的一类蛋白质或多肽，作为构建融合蛋白的标签15、易错PCR：一种利用PCR技术简便快速在DNA序列中随机制造突变的方法，其基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某些组分的数量或质量，随机引入错误碱基从而创造序列多样性的DNA序列文库。16、DNAshuffling：DNA改造，单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片段的随机突变方法。17、硫酸铵分级沉淀：由于不同的蛋白质沉淀所需要的盐离子浓度不同，因此通过调节硫酸铵的浓度可使不同的蛋白质分阶段沉淀下来，这就是硫酸铵分级沉淀18、分子筛层析：是以多孔性凝胶材料为支持物，根据蛋白质分子大小不同，导致阻滞作用不同而先后流出支持物，从而达到分离纯化目的的一种层析方法。19、亲和层析：利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。20、电泳（EP）：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极运动，称为电泳21、噬菌体表面展示技术：是将目的基因克隆在丝状噬菌体衣壳蛋白的基因中，使外源基因产物与衣壳蛋白融合，伸展在噬菌体表面，用来直接检测表达产物活性的一种基因表达筛选技术22、酵母表面展示技术：将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面。23、蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。24、表面等离子体共振（SPR）：是表面等离子体在金属和电介质的交界面上形成的一电荷层，在电磁波的作用下，表面等离子体发生共振的现象。25、蛋白质组：指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。26、蛋白质组学：定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为以及基因表达调控机制的学科27、蛋白质组丰度：某种蛋白质在蛋白质组中的相对含量28、激光捕获显微切割技术（LCM）：激光捕获显微切割是一项在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的原位技术。29、抗体工程：是通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体蛋白序列进行改造，改善抗体某些功能的技术。30、免疫毒素：一种运用蛋白质工程技术将毒素肽与对靶细胞具有高度特异性的抗体连接起来而形成的融合蛋白。31、多克隆抗体：因为抗原性物质具有多种抗原决定簇，所以刺激机体产生了多种B细胞克隆针对不同抗原决定簇产生的混合抗体，并合成分泌各抗体到血清和体液中，这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体。32、单克隆抗体：由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体33、基因工程抗体：又称重组抗体，利用基因重组技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，引入适当的受体细胞，由其表达生产出的预期的抗体分子。问答：1.蛋白质工程与基因工程的联系和区别。基因工程是以DNA双螺旋分子结构为理论基础，以DNA体外操作作为技术基础，按人们意愿改造基因，转入生物体内产生人们期望的产物或新遗传性状的生物。蛋白质工程师从DNA水平改变基因入手，通过基因重组技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白；也就是说蛋白质工程是依赖于基因工程获得蛋白产物，基因工程又为蛋白质工程提供基因克隆，表达、突变及活性检测等关键技术。2.什么是蛋白质构象病？其发病原因是什么？由于蛋白质的空间构象改变而产生的异常的疾病称为构象病。由于组织中特定蛋白质发生了构象改变，进而聚集并产生沉淀，导致生物学功能丧失，出现组织器官的病理性改变的一类疾病。3.维持蛋白质空间构象的作用力有哪些？分别说明。①疏水效应：是蛋白质折叠的主要驱动力，在稳定蛋白质的三维结构方面起重要作用；②氢键：酰氨基与羰基之间常常形成氢键使肽链产生α-螺旋和β-折叠结构；③范德华力：包括吸引力和斥力两种相互作用，具有加和性，对球蛋白的稳定性有一定的作用；④共价交联：如二硫键，同样有助于某些球蛋白的天然构象的稳定；⑤离子相互作用：带有相反电荷的侧链之间的离子相互作用也能帮助稳定球蛋白的结构，但作用很微弱；⑥配位键：两个原子之间由单方面提供共用电子对形成的共价键称为配位键，金属离子往往以配位键与蛋白质连接，参与蛋白质高级结构的形成与维持。4.试述蛋白质分子设计的程序（请辅以图说明）。设计目标蛋白质数据库检测修正设计序列合成结构信息分析建立结构模型获得目标蛋白质首先通过生物信息学对所研究对象的结构和功能信息进行收集分析，建立研究对象的结构模型，在此基础上进行结构-功能关系研究，对其功能相关的结构进行研究和预测，然后提出蛋白质结构改造的设计方案，再通过基因工程改造得到设计产物，并通过相关试验进行验证。根据验证结果进一步进行修正设计，往往要经过几次这样的循环才能成功。5.蛋白质二级结构的设计原则是怎样的？1）α-螺旋的设计原则①选择倾向于形成α-螺旋的氨基酸②设计两亲性的α-螺旋时，为使结构中形成一个亲水面和一个疏水面，疏水性氨基酸残基应按照3或4的间隔排列③为稳定α-螺旋，常常在N端加一个N帽，在C端加一个C帽④设计α-螺旋时，常使带正电荷的氨基酸残基靠近C端，带负电荷的氨基酸残基靠近N端，形成一个N端指向C端的偶极矩2）β-折叠的设计原则选择β折叠片倾向性较大的氨基酸残基使亲水性残基和疏水性残基相间排列3）转角的设计原则选择合适的转角类型6.蛋白质分子设计的种类有哪些？它们各自有哪些特点？1、定点突变或化学修饰法：“小改”，通过定点突变技术或盒式替换技术有目的地改变几个氨基酸残基或化学修饰；2、拼接组装设计法：“中改”，对来源于不同蛋白质的结构域进行剪裁、拼接、组装，获得具有新特点的蛋白质分子，又称“分子剪裁”；3、从头设计全新蛋白质：“大改”，从设计氨基酸序列结构开始进行全新蛋白质的设计，即从头设计一个全新的自然界不存在的蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期功能。7.简述酶分子的修饰方法有那些？金属离子置换修饰；大分子结合修饰，侧链基团修饰，肽链有限水解修饰，核苷酸链剪切修饰，氨基酸置换修饰，核苷酸置换修饰，物理修饰8.为什么要发展基因融合技术？利用基因融合技术可获得由不同功能的蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白基因融合技术有以下优点：①通过与一特异性蛋白质或其特异的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到有效的回收、纯化；②通过与具有不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白；③与报告分子应用于蛋白定位及转基因动物；④可以稳定表达产物的产率，避免目的产物被快速降解；⑤通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以防止包涵体的产生；⑥通过与特定的肽段进行融合表达，可以将表达的外源蛋白定向地定位在宿主的不同区位；⑦是获得蛋白的可靠和可重复性的方法；9.重叠延伸PCR技术引入突变位点的原理是怎样的（请辅以图说明）？该方法必须在特定的待突变位点和上下游分别设计引物，引物A、B为上下游引物，分别与模板链互补，引物C、D为具有互补序列的突变引物，先以引物B、C在一定条件下进行PCR，得产物BC，再以引物A、D进行PCR得产物AD，混合这两个扩增产物，以A、B为引物进行PCR，即可得到带突变点的DNA片段。10.在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素有哪些？如何在大肠杆菌实现外源基因高效表达？启动子的强弱：较强的、能够由一些简单并经济合算的方式诱导启动、控制的本底转录低的启动子，如T7启动子转录终止区：有效的转录终止子mRNA稳定性：通常用非常强的启动子来弥补不稳定的mRNA转录物密码子偏好性：根据其表达所需的密码子偏好性选择相应的载体，或对载体进行适当修饰表达定位：当在细胞外周质和外分泌表达产物时，有利于目的蛋白的纯化，减少细菌对其的降解，实现高效表达；宿主选择：选择正确的宿主菌，对外源基因在原核系统中的表达水平会产生一定的影响；培养条件控制：大肠杆菌的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高。11.重组蛋白质的表达系统主要有哪些？各自的优缺点是什么？同基因工程制药大题第十题书P4312.Western-blotting的主要实验原理、操作步骤如何？通过特异性抗体对凝胶处理过的细胞或生物组织样品进行着色，然后通过分析着色位置和深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或生物组织中表达情况的信息。主要包括三个步骤：第一步：凝胶电泳；第二步：转膜，把凝胶上的蛋白质条带转移固定到薄膜上；第三步：抗原抗体显色反应。13.离子交换层析分离纯化蛋白质的主要原理、实验步骤如何？蛋白质在一定的pH下带有电荷，不同的蛋白质所带的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同，这样，混合蛋白质在电场作用下，电荷吸引力作用小的蛋白质先流过凝胶，大的后流出，从而将蛋白质分离纯化。主要有三大步骤：凝胶预处理；装柱；平衡，上样，洗脱，检测和收集。14.下图是人G6PD蛋白的理化性质信息图，由图中你能得到哪些信息？氨基酸总数相对分子总量等电点氨基酸组成及其比例酸性氨基酸数碱性氨基酸数原子组成及含量分子式总原子数15.下图是人beta-globin的理化性质信息图，由图中你能得到哪些信息？16.如何利用表面等离子体共振（SPR）仪研究蛋白质相互作用？先在传导膜上用配体进行修饰，然后对溶液的待分析物的相互作用进行测定。当样品中的分子结合到传感器表面时，表面的浓度变化导致了折射率的变化。这样就可以检测到SPR反应，以反应-时间做出传感图，这样就提供了一个定量的测定分子间相互作用的方法。17.如何利用蛋白质错误折叠循环扩增技术（PMCA）设计一个灵敏的朊病毒（PrPsc）检测方法？在动物组织中提取出痕量的PrPsc和大量的PrPc，进入PMCA循环的第一个阶段，让两者共同培育，在外界条件下促使PrPc向PrPsc转化，形成PrPsc聚合体；第二阶段用超声波对样品处理，以打碎PrPsc聚合体。使PrPsc“种子”数量得到增加，从而进行PrPsc循环扩增，使其达到常规方法能够检测到的程度。18.蛋白质组学研究的技术方法主要有哪些？双向电泳技术、激光捕获显微切割技术；图谱分析技术；生物质谱技术；同位素亲和标签；表面增强激光解吸电离飞行时间质谱；荧光差异凝胶电泳；多维液相层析质谱技术；19.列举并详细说明三种研究蛋白质相互作用的方法。①SPR技术：先在传导膜上用配体进行修饰，然后对溶液的待分析物的相互作用进行测定。