酶与蛋白质工程第5章基因突变与蛋白质改造.

第五讲基因突变与蛋白质改造变异的类型可遗传的变异：不可遗传的变异：基因突变染色体变异基因重组仅仅由环境不同引起，遗传物质没有改变，不能进一步遗传给后代由于生殖细胞中遗传物质发生了改变，其后代将继承这种改变生物变异的类型生物变异“人造美女”结婚后所生的孩子一定会像她一样的美丽吗？中国第一位人造美女北京培育的优质甘蓝品种，叶球最大的有3.5KG，当引种到拉萨后，由于昼夜温差大、日照时间长、光照强，叶球可重达7KG左右。但再引回北京后，叶球又只有3.5KG。为什么？3.5kg7kg3.5kg甘蓝拉萨北京在种植花卉时，发现红花的后代出现了蓝紫花，蓝紫色花的后代仍是蓝紫色。这种现象是哪类变异？红花的后代变了蓝紫色蓝紫色花后代仍是蓝紫色基因突变类型从遗传物质结构的改变：碱基的置换、移码、缺失、插入突变从突变效应与野生型的关系：正向、回复突变从突变所引起遗传信息的意义改变：同义、错义、无义突变如突变发生在调控区：组成型突变、启动子上升/下降突变、抗阻遏、抗反馈突变从突变所带来的表型改变：形态、致死或条件致死、生化突变型分类标准从突变产生的过程：自发、诱发突变基因突变基因突变机制基因突变的原因多种多样，可以是自发或诱发具体类型可归纳如下：基因突变点突变可分为单点突变（Singlepointmutation）和多点突变（multiplemutation）单点突变指只有一个碱基对发生改变，多点突变指有两个或两个以上碱基对发生改变点突变常分为两类一类叫转换（transition），即嘌呤被另一嘌呤取代或嘧啶被另一嘧啶取代后而发生的变化另一类叫颠换（transversion）即嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤取代后而发生的变化点突变的重要特点之一是它具有较高的回复突变率基因突变回复突变突变体所失去的野生型性状可以通过第二次突变得到回复，这种二次突变就是回复突变正向突变改变野生型性状的突变基因突变碱基插入突变DNA链中插入1个或几个碱基对,这种突变可以引起其后DNA序列的读框发生改变,故又称为移框突变（frameshiftmutation）移框突变的结果不但改变了表达产物的氨基酸组成，而且会出现新的终止密码子，而使蛋白质合成过早终止碱基缺失突变DNA链中缺失1个或数个甚至小片断的碱基对。这种突变也可引起其后DNA序列的读框发生改变基因突变同义突变碱基被替代后,没有改变产物氨基酸序列，这是与密码子简并性相关,如CTT、CTC、CTA、CTG的第3位碱基互相替代后其编码表达的产物均为亮氨酸,CTT、CTC、CTA、CTG的第3位碱基互相替代后,其编码表达的产物均为脯氨酸，因此这种突变不产生突变效应错义突变碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至完全失去活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变无义突变碱基的改变可使某种氨基酸的密码子突变为终止密码子。如赖氨酸的密码子AAG突变为终止密码子TAG，酪氨酸的TAC突变为TAA或TAG终止密码子。若无义突变的终止密码子使肽链合成过早终止,蛋白质产物一般没有活性，若是发生在基因DNA的3’末端处，它所表达产生的多肽常有一定活性或有部分活性，这种突变又称为渗漏变型基因突变野生型菌株：从自然界分离获得的菌株，称之为野生型基本培养基(MM)：满足野生型菌株生长最低营养要求的合成培养基基因突变营养缺陷型：野生型菌株由于突变而丧失了某种营养合成能力，而无法在基本培养基上生长的变异类型抗性突变型：野生型菌株由于突变产生对某些化学药物或致死物理因子抗性变异类型条件致死突变型：基因突变后，在某种条件可生长并实现表型，而在另一条件却无法生长繁殖的突变类型(如温度敏感突变株）形态突变株抗原突变株产量突变株基因突变突变株类型划分：----选择性突变株：营养缺陷型、抗性突变型、条件致死突变型----非选择突变株：形态、抗原、产量突变型基因突变命名规则1.根据基因产物或其作用产物的英文名称第一个字母缩写成3个小写斜体字母来表示2.不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在3个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。如Recombination→recA、recB、recC基因突变3.突变位点通过在突变基因符号后加不同数字表示。如supE444.某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“∆”表示。例如：lac-proAB基因缺失时它的基因型表示为∆(lac-proAB)。5.融合如Φ（ara-lac）表示ara和lac融合成新基因基因突变的特征随机性独立性稳定性可逆性稀有性基因突变规律基因突变从以下图片，能归纳出基因突变的什么特点吗？白眼果蝇白化苗基因突变的普遍性白色皮毛牛犊白化病患者高产大豆高产青霉菌株大南瓜太空椒（左）有利的基因突变白化病患者有害的基因突变白化玉米苗畸形雏鸭人类的多指灰老鼠基因突变的随机性、不定向性实验结果证明两套平板上耐噬菌体菌落数差异很大证实细菌自身发生突变，而外界条件仅起选择作用波动实验自发突变基因突变平板影印培养试验经过数次重复，获得一株完全没有接触过链霉素的高度耐链毒素的突变株，表现为原始平板上全部菌落与含链霉素平板上的菌落吻合证明链霉素仅起选择作用自发突变主要原因1.互变异构2.生物自身所产生诱变物质的作用3.背景辐射和环境诱变基因突变碱基置换诱变原理Watson和Crick认为酮式与烯醇式的互变氨基与亚氨基的互变碱基碱基配对方式改变自发突变10-6－10-10基因突变各种药物抗性突变的发生彼此独立无关抗药性是一种数量性状，有单基因决定的，如链霉素；也有多基因决定的，如青霉素和氯霉素巨大芽孢杆菌对异烟肼抗性突变率是5×10-5对氨基柳酸抗性突变的突变率是1×10-6兼抗两者的突变体是8×10-10大约是两者的乘积突变对细胞是随机的，突变对基因也是随机的基因突变突变的随机性抗药性突变型的稳定性及回复突变•稳定性：无药物存在时，抗药性能稳定保持和遗传。以此可以区别抗性是由于基因突变还是生理适应•抗药性突变的回复突变：频率同样很低抗药性突变的突变率可通过某些理化因素的处理而提高基因突变突变又不完全是个随机过程•突变热点(hotspotsofmutation）理论上讲，DNA分子上每一个碱基都可能发生突变，但实际上突变部位并非完全随机分布•DNA分子上的各个部分有着不同的突变频率，即DNA分子某些部位的突变频率大大高于平均数，这些部位就称为突变热点•无论是自发还是诱发突变中都有热点存在基因突变突变热点产生原因•5-甲基胞嘧啶（MeC）的存在，MeC脱氨氧化后生成T，引起G－MeC→A-T转换；•短连续重复序列处容易发生插入或缺失突变；•与突变剂种类有关，如DNA顺序中某个碱基对突变剂更敏感，有的则相反；•相邻碱基对的影响基因突变诱变剂与诱变机制诱变剂：能使突变率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因素自发突变的频率较低，基因的每个核苷酸突变率平均为10-9～10-10。相反如果在人为条件下，使用某种突变剂处理生物体而产生的突变称为诱发突变（inducedmutation）。诱发突变频率高得多（千倍以上），而且现在可在离体条件下，使细胞发生定向诱发突变，称为定向突变。有生殖细胞突变和体细胞突变诱变机制：•碱基置换突变•移码突变•插入/缺失突变基因突变碱基类似物-5BrU，5-溴脱氧尿嘧啶核苷酮式烯醇式碱基类似物基因突变烯醇式：与G配对诱发G.C→A.TG.CG.CG.BUG.CA.BUA.TA.BU参入错误酮式：与A配对诱发A.T→G.CA.TA.TA.BUA.TG.BUG.CA.BU复制错误另一种碱基类似物：2-氨基嘌呤(AP)类似于A异构体：酮式烯醇式配对形式：AP=TAP≡C基因突变碱基的化学修饰Nitrousacid(HONO，亚硝酸)基因突变Nitrousacidcytosineuracil,guaninexanthineGX（黄嘌呤）adeninehypoxanthineAH（次黄嘌呤）A:T→G:CH与C配对G：C→A：TG.CG.C*G.CC.A*C.A*T.AHAHydroxylamine(NH2OH，羟胺)基因突变烷化剂EMSNNGMMS基因突变甲基磺酸乙酯甲烷磺酸甲酯亚硝基胍烷化剂对DNA的损伤机制一类亲电子的化合物，易与生物体中大分子的亲核位点反应可使DNA发生各种类型的损伤：a.碱基烷基化：烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化，例如鸟嘌呤N7被烷化后就不再与胞嘧啶配对，而改与胸腺嘧啶配对，结果会使G-C转变成A-Tb.碱基脱落：烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变基因突变d.交联：烷化剂有两类•一类是单功能基烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只能使一个位点烷基化；•另一类是双功能基烷化剂，化学武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等，某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类，其两个功能基可同时使两处烷基化•结果就能造成DNA链内、DNA链间，以及DNA与蛋白质间的交联基因突变c.断链：DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂EMSandMMStendtoethylate(ormethylate)N7ofguanineorN3ofadenine,whichseverelydisruptsbasepairing基因突变是一种诱变作用特别强的诱变剂可以使一个群体的任何一个基因的突变率高达1%。此外可以诱发邻近位置的基因同时发生突变，即引起多位点突变NNGcaninadditionmethylatetheO6ofguanineandtheO4ofthymine基因突变移码突变DNA分子中一对或几对核苷酸的增加和缺失造成的基因突变•引起移码突变的诱变剂：如吖啶橙，原黄素，吖黄素，可掺入DNA碱基对之间，引起DNA双链错位•移码突变机制：基因突变辐射诱变热紫外线UV电离辐射激光离子束诱变基因突变有效诱变范围：200～300nm紫外线引起的DNA损伤UV：非电离辐射型波长范围：136～390nm诱变机制：DNA链的断裂DNA分子的交联C、U的水合作用嘧啶二聚体的形成基因突变UV照射形成嘧啶二聚体电离辐射引起DNA损伤直接效应-DNA直接吸收射线能量而遭损伤间接效应-DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基而损伤DNA基因突变电离辐射可导致：a.碱基变化主要是由OH-自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感;b.脱氧核糖变化脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂;c.DNA链断裂是电离辐射引起的严重损伤事件，断链数随照射剂量而增加;d.交联包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联激光诱变激光：电磁波机制：辐射活化效应,使机体形态结构和代谢生理方面发生改变离子束诱变机制：能量传递、动量交换、离子沉积和电荷积累基因突变MutagenMechanismTypesofmutationsproducedSpontaneousDNAreplicationandrepairerrors,spontaneousmodificationofnucleotidesAlltypesofmutationsproducedUVirradiationPyrimidinedimersinduceerrorpronerepair(SOS)MainlyG-CtoA-Ttransitions,butallothertypesofmutationsincludingdeletions,frameshifts,andrearrangementsatsomewhatlowerfrequency2-aminopurine(2AP)BaseanalogA-TtoG-CandG-Cto