酶工程学-第二三周生物合成理论

酶工程学EnzymeEngineering•绪论(第一章)•酶的生产•酶的改性•酶的应用酶生物合成的基本理论(第二章)酶的生物合成法(第三章)酶的提取与分离纯化(第四章)酶改性的基本理论(第五章)酶分子修饰(第六章)酶固定化(第七章)酶的非水相催化(第八章)酶应用的基本理论(第九章)酶反应器的应用(第十章)酶的应用领域(第十一章)第二章酶生物合成的基本理论酶的生物合成——通过细胞的生命活动而合成各种酶的过程。酶有蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别，酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程。第一节RNA的生物合成——转录一、中心法则1958年Crick：一、中心法则1958年Crick：？发现逆转录病毒（1970）朊粒羊瘙痒症水貂脑软化病马鹿和鹿的慢性消瘦病猫的海绵状脑疯牛病克雅氏综合症1976年，美国，Gajdusek，诺贝尔生理学和医学奖1997年，美国，Prusiner，诺贝尔医学或生理学奖WM＝分子量在2.7万～3万朊病毒：又称蛋白质侵染因子（又称毒阮）。朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。复制机理：1.合成朊病毒所需的信息，有可能是存在于寄主细胞之中的，而朊病毒的作用，仅在于激活在寄主细胞中为朊病毒的编码的基因，使得朊病毒得以复制繁殖。2.朊病毒的蛋白质能为自己编码遗传信息。逆转译蛋白质本身可作为遗传信息3.1982年Prusiner提出了朊病毒致病的“蛋白质构象致病假说”1.以“DNA”为“中心”的中心法则解读2.以“RNA”为“中心”的中心法则解读（1）不具有逆转录行为的RNA病毒的中心法则之解读（2）具有逆转录行为的RNA病毒的中心法则之解读二、RNA的生物合成——转录RNA的种类dsRNA:某些病毒遗传信息载体催化活性RNA：催化作用tRNA：氨基酸载体rRNA：与蛋白质共同组成核糖体mRNA：蛋白质合成模板sRNA：分子修饰、代谢调节作用（一）RNA的种类和主要功能以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在依赖DNA的RNA聚合酶作用下，生成RNA的过程。（二）转录RNA+4nPPinATPnGTPnCTPnUTPDNA模板，Mg2+/Mn2+RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶：MW=5x105（三）RNA聚合酶全酶：由ββ’αωσ组成，识别转录起始位点，与DNA上的启动基因结合，使转录开始。核心酶：由ββ’αω组成，进行核苷酸链的延伸。1960年，Harowitz和Weiss真核生物RNA聚合酶：三种聚合酶种类RNA聚合酶IRNA聚合酶IIRNA聚合酶III别名rRNARNA聚合酶不均一RNA聚合酶小分子RNA聚合酶存在位置核仁核仁核质相对分子质量/103550600600催化反应产物rRNAmRNAtRNA5SrRNARNA生物合成的起始位点在DNA的启动基因（启动子)上（四）转录的起始起始阶段的重要问题是RNA聚合酶与DNA的启动基因的相互作用，起始阶段包括：全酶的形成酶与模板结合酶与启动基因结合模板DNA局部变性转录开始酶的移动方向（五）转录的延伸重旋解旋转录泡，17bp（六）转录的终止大肠杆菌中的两类终止子：不依赖于ρ因子的终止子依赖于ρ(rho)因子的终止子模板DNA分子上每个基因或每个操纵子都含有一个终止信号——终止子。当RNA聚合酶转录到达这个信号时，合成的RNA分子以及聚合酶与模板DNA分离，RNA链的合成便被终止。1.不依赖于ρ因子的终止子2.依赖于ρ因子的终止子1.剪切反应2.剪接反应3.末端连接反应：（七）RNA前体的加工•tRNA3’-末端加上CCA-OH尾巴•在mRNA的5’-末端加上“帽子”结构5’-m7GpppNmpNp•在mRNA的3’-末端连接polyA尾巴•tRNA5’-末端加上甲基鸟苷酸4.核苷修饰反应tRNA3’-末端加上CCA-OH尾巴CCA-OH尾巴的功能：•CCA是连接氨基酸所不可缺少的在mRNA的5’-末端加上“帽子”结构5’-m7GpppNmpNpmRNA（核苷-2’）甲基转移酶RNA三磷酸酶mRNA鸟苷酰转移酶mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶5’帽子的功能：•翻译起始所必要的，为核糖体识别mRNA提供了信号，并协助核糖体与mRNA结合使翻译从AUG开始。•帽子结构可增加mRNA的稳定性，保护mRNA免遭5’→3’核酸外切酶的攻击。在mRNA的3’-末端连接polyA尾巴Poly（A）尾巴的功能：•防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解，起缓冲作用。•可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关。但是相当数量的没有polyA尾巴的mRNA如组蛋白mRNA，也能通过核膜进入细胞质。第二节蛋白质的生物合成——翻译二、蛋白质的生物合成——翻译以mRNA为模板，以各种氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程，称为翻译。遗传密码的简并性：密码子5’-XYZ-3’反密码子3’-X’Y’Z’-5’61种密码——20种氨基酸遗传密码的通用性密码子与反密码子的相互作用：mRNAtRNACrick根据立体化学原理，于1966年提出了摆动假说：密码子与反密码子的配对中，前两对严格按照碱基配对原则，而第三对碱基则可以有一定自由度地摆动，所以，某些tRNA的反密码子可以识别一个以上的密码子。1.氨基酸活化生成氨酰-tRNAaa＋tRNA+ATPaa-tRNA+AMP+PPi氨酰-tRAN合成酶分两步进行：aa+ATP+E→E-aa-AMP+PPiE-aa-AMP+PPi→aa-tRNA+E+AMP大肠杆菌，肽链合成的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸：Met＋tRNAF+ATP→Met-tRNAF+AMP+PPi甲酰转移酶fMet-tRNA2.肽链的合成起始3.肽链的延伸GDP+Pi4.肽链的终止终止密码子：UAA,UAG,UGA释放因子（ReleaseFactor）:RF-1：UAA,UAGRF-2：UAA,UGA5.翻译后加工去除甲酰基去除N-末端的氨基酸肽链折叠第三节酶生物合成的调节转录水平的调节转录产物的加工调节翻译水平的调节翻译产物的加工调节酶降解调节组成酶：细胞内含量恒定，环境因素对这些酶的合成效率影响不大。DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的酶。调节酶：在细胞内含量变化很大，合成速率明显受环境因素影响。诱导酶：在诱导物作用下开始或加速合成。b－半乳糖苷酶酶的类型酶合成的调节控制一、原核生物中酶生物合成的调节1960年Jacob和Monod提出的操纵子学说（一）操纵子学说调节基因：产生阻遏蛋白启动基因操纵基因：与阻遏蛋白结合结构基因：蛋白多肽链产物操纵子1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点操纵子学说主要内容操纵子学说：操纵子（operon）是指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称，是转录的功能单位。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。…RPOS1S2……DNA调节基因启动基因操纵基因结构基因与阻遏蛋白结合1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点产生阻遏蛋白mRNA操纵子原核生物中操纵子的类型1.诱导型操纵子：在无诱导物的情况下，基因的表达水平很低或不表达，只有当存在诱导物时,才能转录生成mRNA，进而合成酶。例如乳糖操纵子。2.阻遏型操纵子：在无阻遏物情况下，基因表达正常，当有阻遏物存在时，转录受到阻遏。例如色氨酸操纵子。（二）原核生物中酶生物合成的调节机制1.分解代谢物阻遏作用2.酶生物合成的诱导作用3.酶生物合成的反馈阻遏作用1.分解代谢物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。cAMP↓+H2OAMP↓磷酸二酯酶葡萄糖过量降解ATPADP,AMPcAMP-CRP↓启动基因上没有cAMP-CRP结合酶合成↓例：葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成2.酶生物合成的诱导作用加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程。简称为诱导作用，起诱导作用的物质，称为诱导剂。催化作用的底物底物的类似物举例：乳糖诱导β-半乳糖苷酶的合成3.酶生物合成的反馈阻遏作用（产物阻遏作用）是指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程。引起反馈阻遏的物质，称为共阻遏物。催化作用的产物代谢途径末端产物举例：无机磷酸阻遏碱性磷酸酶无阻遏物时：添加阻遏物时：…RPOS1S2…DNA翻译mRNA…RPOS1S2…DNA共阻遏物磷酸单酯磷酸+醇碱性磷酸酶二、真核生物中酶生物合成的调节机制1.细胞分化改变酶的生物合成2.基因扩增加速酶的生物合成3.增强子促进酶的生物合成4.抗原诱导抗体酶的生物合成1.细胞分化改变酶的生物合成端粒酶催化端粒的延伸3’5’5’TTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA3’5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA3’5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’CCAACCCC3’5’端粒酶RNADNA（1）结合（2）延伸（3）移位2.基因扩增加速酶的生物合成基因扩增：是通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式。例：CHO在含有氨甲蝶呤的培养基上培养编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增，二氢叶酸还原酶合成速度加快。增强子：又称调变子，是一段能够高效增强或促进基因转录的DNA序列。增强子的重要特性是能够促进同源或异源启动基因的转录活性，其增强效果有时可达1000倍。3.增强子促进酶的生物合成4.抗原诱导抗体酶的生物合成1948年Pauling提出过渡态理论1975年Kohler合Milstein发明单克隆抗体技术1986年Lerner合Schultz分别独立获得具有催化活性的抗体