酶法生产低聚异麦芽糖和酵母分离纯化研究

《酶法生产低聚异麦芽糖及酵母分离纯化研究》ProductionofIsomalto-OligosaccharidessyrupbyenzymaticmethodandpurificationthroughYeastCells崔静，罗希韬，邱学良周娟（山东福田科技集团有限公司，青岛266071）CuiJing,LuoXi-tao,TianQiang（ShandongFutasteCo.,Ltd,Qingdao266071）通讯作者：罗希韬（1986-），男，工学硕士学位，主要从事糖醇生产技术及研究开发。摘要：本文研究了以玉米淀粉为原料生产低聚异麦芽糖（IMO）的工艺，主要涉及酶法获得低纯度IMO和酵母纯化工艺两部分。首先将玉米淀粉液化和糖化，然后转苷生成低纯度IMO。低纯度IMO通过酵母发酵法除去可代谢糖类（葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖等），有效地转化成高纯度的IMO。酿酒酵母可以发酵除去IMO糖浆中的葡萄糖，在麦芽汁中培养的酵母还可以发酵麦芽糖和麦芽三糖。发酵3d后，生成高纯度的IMO，主要成分为异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖占总糖98%以上。酵母发酵过程中，酵母细胞的死亡率的增加取决于发酵策略和低纯度IMO的浓度，对数期的酵母细胞发酵效果优于稳定期的酵母细胞。关键词：低聚异麦芽糖；异麦芽糖(Isomaltose,IG2)；潘糖（Panose,P）；异麦芽三糖（Isomaltotriose,IG3)；α-葡萄糖苷酶；酿酒酵母，分离纯化Abstract：Thispaperstudiesontheproductionofisomaltooligosaccharideswithcornstarch,mainlyreferstoproductionoflow-purityIMOanditspurificationthroughyeastcells.Thecornstarchwasenzymaticallyliquefiedandsaccharified,thenconvertiedtolow-purityIMObytransglucosylation.Thelow-purityIMOcouldbeefficientlyconvertedtohigh-purityIMObyyeastfermentationtoremovedigestiblesugarsincludingglucose,maltoseandmaltotriose.Saccharomycescerevisiaewasabletofermentglucose,andcouldalsotofermentmaltoseandmaltotriosewhenharvestedfromthemediumofmaltjuice.After3-dayfermentation,theresultanthigh-purityIMOincludingmainlyisomaltose,panose,andisomaltotriosemadeupmorethan98%ofthetotalsugars.Duringthecourseoffermentation,thelevelofyeastdeathincreasedwiththefeedconcentrationoflow-purityIMO,andvariedwiththefermentationstrategies.Keyword：Isomaltooligosachcharides(IMO);Isomaltose(IG2);Panose(P);Isomaltotriose(IG3);α-Glucosidase;Saccharomycescerevisiae;purification低聚异麦芽糖（Isomaltooligosachcharides，简称IMO），属于淀粉糖范畴，主要成分为以葡萄糖为单体通过α-1,6糖苷键结合组成的异麦芽糖(Isomaltose,IG2)、潘糖（Panose,P）、异麦芽三糖（Isomaltotriose,IG3)及四糖以上的低聚糖[1-3]。低聚异麦芽糖具有良好的抗龋齿性、难发酵性和保湿型，可有效提高肠道益生菌群双歧杆菌的数量，尤其是作为益生元的应用方面，已经得到了广泛的关注[4]。低聚异麦芽糖在自然界中极少以游离状态存在，但作为支链淀粉或多糖的组成部分，在某些发酵食品如酱油、黄酒或酶法葡萄糖浆中有少量存在[5]。麦芽糖是两个葡萄糖分子以α-1,4糖苷键连接起来的双糖，异麦芽糖（Isomaltose）则是两个葡萄糖分子以α-1,6糖苷键连接起来的双糖。因此，低聚异麦芽糖可以通过微生物分泌的具有转苷作用的酶进行生产。工业上以淀粉为原料生产低聚异麦芽糖，反应用酶为α-葡萄糖苷酶，又名葡萄糖基转移酶，简称α-糖苷酶，主要在真菌中存在，如黑曲霉、出芽短梗霉[6]。它能切开麦芽糖和麦芽低聚糖分子结构中α-1,6糖苷键，并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖或麦芽三糖等分子中的α-1,6位上，形成异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖和潘糖等。转苷反应生成的不仅有α-1,6糖苷键连接的葡萄糖低聚物，还伴随生成大量副产物，葡萄糖和α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖以上的低聚糖和葡萄糖。其中，IG2、P和IG3是体现IMO功能的主要成分。传统的用淀粉生产IMO的方法，产品最高纯度可达到60%左右，产品中的葡萄糖和麦芽糖的存在影响了其功能性和理化特性，制约其终端产品的开发和应用。关于IMO的纯化研究，主要有色谱柱分离法和纳滤膜分离法，也有采用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶协同除葡萄糖的方法，不仅工艺繁琐，且成本高[7-9]。本研究首先将玉米淀粉进过液化、糖化得到高纯度麦芽糖浆；以麦芽糖浆为底物，经过α-葡糖苷转移酶反应制备低纯度IMO。然后利用IMO的难发酵性，通过酿酒酵母发酵的方法，除去可消化的糖类，如葡萄糖(G)、麦芽糖(G2)和麦芽糖三糖(G3)，得到高纯度的IMO（纯度可达到98%以上）。1材料和方法1.1实验用酶制剂及酵母实验所用耐高温α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶、真菌α-淀粉酶均购自诺维信(中国)生物技术有限公司品；α-葡萄糖转苷酶购自福建福大百特科技发展有限公司，酶活力30000U/mL。玉米淀粉取自山东福田药业有限公司麦芽糖醇车间；酵母株系，湖北安琪酵母股份有限公司生产的高活性干酵母。1.2仪器设备恒温培养振荡器、722型分光光度计、手持糖量计、高效液相色谱仪（岛津）、精密电子天平、冷冻离心机、电热恒温水浴锅、水浴恒温振荡器、电动搅拌机、显微镜、细胞计数板、超净工作台。1.3实验方法1.3.1低纯度低聚异麦芽糖的制备玉米淀粉用去离子水稀释调浆至质量分数20%，稀释后的体积为2L，Ca2+含量为30ppm(CaCl2溶于水)。调节pH至6.0，添加耐高温-α淀粉酶（干物质量的0.15%），93℃-95℃下水浴保温1h，根据碘试结果确定淀粉液化时间的终止。然后将液化液温度降至55℃，调节pH为5.5，补加水浴过程中挥发出的水分。添加干物质量0.05%的普鲁兰酶和干0.1%的β-淀粉酶或0.1%真菌α–淀粉酶糖化48h。生成的淀粉溶液混合物加入α-葡萄糖苷酶，在58℃下进行转苷反应28h.然后升温至85℃保温15min灭酶活。补加去离子水分别将IMO溶液调至折光率约20%和30%，待发酵。玉米淀粉制备的IMO如表1所示。1.3.2酵母发酵法制备高纯度的IMO利用麦芽汁培养基，培养酵母细胞。麦芽汁培养基的配制：在容器中将10Kg麦芽粉与40L水混合，加热至50℃糖化3h后过滤，将滤液完全煮沸，可作为麦芽汁培养基。称取1.0g干酵母菌然后接种于100mL的三角锥形瓶中进一步摇瓶培养，摇床转速为150rpm，恒温30℃，培养时间4h，细胞密度为1.5×108/mL，台盼蓝染色率为1%。IMO发酵：将100mL酵母培养液在5000rpm下离心20min，去除上清液收集并洗涤酵母细胞，与100mL低纯度的IMO混合后进行摇瓶发酵，在转速80rpm，温度30℃下培养36h。1.3.3发酵过程酵母细胞活力检测：台盼蓝染色法检测细胞的活性，在计数前加入台盼蓝，死细胞膜完整性丧失被呈深蓝色，而活细胞膜完整能因而不能被染色，染色率可以估算细胞的存活率。1.3.4产物组成的检测利用高效液相色谱法分析产物组成：低聚糖样品用去离子水稀释后通过高效液相色谱仪检测（配有示差折光检测器和柱温控制系统）,TskgelAmide-80氨基键合柱（4.6mm×250mm），柱温：75℃，流速：1.0mL/min,进样量：1μL。2结果及分析2.1玉米淀粉生产低纯度IMO玉米淀粉在液化、糖化以及转苷时寡糖的组分的变化分别汇总于表1（总IMO量包括异麦芽糖、潘糖和异麦芽四糖）。表1与，玉米淀粉在液化、糖化和转苷时低聚糖的组分变化Table1Thehecompositionsofoligosaccharidesintheprocessforliquefaction,enzymatichydrolysis,andtransglucosylationofcornstarch样品G(%)G2(%)G3(%)IG2(%)P(%)IG3(%)IG4(%)IMO（%）11.548.411.5600000213.4678.653.8700000317.5872.896.8700000428.1910.643.2728.7610.5814.583.9457.86529.4610.392.9827.6910.9614.903.8257.371:液化液；2：0.05%普鲁兰酶和0.1%与β-淀粉酶糖化后的糖化液1；3：0.1%真菌α–淀粉酶糖化后的糖化液2；4：糖化液1加0.1%的α-葡萄糖转苷酶转苷28h；5：糖化液2用0.1%的α-葡萄糖转苷酶转苷28h.经过耐高温α-淀粉酶液化之后，淀粉部分被水解成α-1,4糖苷键连接的片段，主要是糊精和麦芽糖低聚物，然后用0.1%的β-淀粉酶（作用于α-1,4糖苷键连接的片段）和0.05%的普鲁兰酶（作用于α-1,6糖苷键连接的片段）进行糖化。糖化后产物主要是麦芽糖，此外还有葡糖糖、麦芽三糖等。第二种糖化方法是用真菌α-淀粉酶进行糖化，这种酶来源于黑曲霉，可以作用于α-1,4糖苷键连接的片段，产物主要是麦芽糖和麦芽三糖，尽管麦芽糖的纯度低，但是小分量糖的总量（包括葡萄糖和麦芽二糖到四糖）与β-淀粉酶与普鲁兰酶共同糖化后产物相当。这在两种方法得到的糖化液中加入葡萄糖转苷酶，得到纯度几乎相同的IMO，表明：α-葡萄糖转苷酶可以有效地将麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖的葡糖糖苷转移。玉米淀粉在转苷之前进行两步法处理包括液化和糖化，是生产低纯度IMO的有效方法。2.2酵母发酵法得到高纯度IMO酵母在麦芽汁培养基培养后，可发酵除去上述低纯度IMO中的可代谢糖类，可得到高纯度的IMO，实验结果如表2所示。可代谢糖类如葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖可以被酵母代谢除去，但是IMO组分因不能被代谢而保留。经过36h发酵后，可代谢糖类被完全除去，得到高纯度的IMO。葡萄糖在发酵12h后几乎被完全除去，而麦芽糖在发酵24h后被完全除去。表2酶法制备的低纯度IMO糖浆制备高纯度IMOTable2Productionofhigh-purityIMOfromlow-purityIMOsyrupmadebystarchofcorn死亡率G去除率(%)G2去除率(%)G3去除率（%）IMO浓度(%)12h24h36h12h24h36h12h24h36h12h24h36hIMO(%)202.54.06.099100100941001006010010099.8302.51120921001008096100307010099.4实验结果表明，酵母发酵法是去除低纯度IMO中可代谢糖，生产高纯度IMO的有效方法。当低纯度IMO发酵36h后，可以完全除去可代谢糖类，得到纯度近乎100%的纯IMO。2.3培养24h的酿酒酵母：干酵母对低纯度I