酶组织化学

组织化学(Histochemistry)姜玉峰石河子大学医学院组胚教研室一、组织化学的基本概念（一）组织化学的提出（二）组织化学的定义在保持组织或细胞基本上不改变其生活状态时的微细结构的条件下，采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律;定性，定位，定量;组织原位，显微镜一、组织化学的基本概念铅法（ATP酶）HE染色醛复红染色HE染色一、组织化学的基本概念（三）组织化学的基本原理化学试剂+拟检物质反应产物沉淀↓（有色）（组织切片或细胞涂片）（拟检物质所在处）化学反应一、组织化学的基本概念（四）组织化学技术的用途酶组织化学（enzymohistochemistry）一.概述酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质;酶组织化学利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法;酶组织化学发展历史1.1868年Klebs过氧化物酶；2.1939年Takamatsu、Gomori碱性磷酸酶；3.电镜酶组织化学1955年Scheldon将电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和碱性磷酸酶；4.免疫酶组织化学1970年Sternberger酶标抗体法目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100余种酶的种类1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂合酶5.异构酶6.合成酶二.酶组织化学反应的基本知识（一）酶的特性水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂有机溶剂不同程度降低酶的活性易受温度影响，对热耐受性弱对干燥耐受性强（二）酶的定位酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位5‘-核苷酸酶——浆膜ATPase——肌球蛋白细胞膜线粒体(三）酶组化的基本条件同时保存结构和酶的活性保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：温度PH值抑制剂激活剂（四）原理及一般原则1.基本原理细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物）然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在第一反应：酶促反应底物初级反应产物（PRP）第二反应：捕捉反应PRP+捕捉剂终反应产物（FRP）酶PRP弥散：1.底物在酶催化下水解的速度2.PRP在缓冲液中的弥散系数3.PRP与辅助物反应的速度应选择合适的底物和辅助物,减少弥散捕捉剂的浓度（1mg/ml）2.一般原则1.对组织处理,制片过程不能影响酶的活性及分布2.所选底物和辅助物必须迅速,同步穿透入组织和细胞中3.所选底物最好只能被一种酶催化分解4.所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反应试剂的穿透性5.PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色稳定产物6.所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合(五)酶组织化学的主要步骤1.酶的固定（fixation）2.酶的特异性反应（specificreaction）3.在最适条件下,酶反应产物的沉着（precipitation）4.使沉着物具有可见性（visualization）组织/细胞制作切片酶反应（孵育）显色封片镜检（六）各步骤注意问题1.检测方法的选择2.酶的保存与固定一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片-70℃长期保存固定的目的：1）保持组织细胞原有的形态结构2）使组织硬化常用固定剂1、甲醛：HCHO40%甲醛溶液的商品名称为福尔马林，10%福尔马林多聚甲醛:（HCHO)n，n=8〜1004%多聚甲醛溶液2、戊二醛：C3H10(CHO)22〜4%戊二醛溶液3、乙醇：CH3CH2OH80%乙醇溶液方法：推注，滴注滴注步骤：1、开胸2、暴露心脏3、自心尖剪开左心室4、插入灌流针至主动脉弓5、固定灌流针6、快速注入冲洗液7、先快后慢注入固定液8、慢注毕，取材恒冷箱切片1、骤冻2、防冰晶防冻剂：10〜30%蔗糖溶液电镜切片的制备（一）包埋前染色切片法1、恒冷箱切片2、振荡切片机切片（二）包埋后染色切片法异戊烷或乙烷等液氮(－197℃)或干冰（-78℃）组织块恒冷箱切片：组织取材和固定或不固定→骤冻（液氮，–198℃；干冰，–78℃；冻结金属座，–30℃）→切片（恒冷柜）→粘片（载玻片）→晾片→组织化学染色程序（六）各步骤注意问题3.切片制作:切片厚度40um4.缓冲液选择缓冲液用于A.配置固定液B.漂洗液C.配置酶反应孵育液选择缓冲液应注意A.不能减弱目标酶的活性B.不能含有与捕捉机制相同的物质C.注意漂洗用缓冲液的渗透压D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同（六）各步骤注意问题5.孵育反应A.孵育液配置B.孵育的温度和时间:37℃15-30minC.切片孵育法-切片孵育-漂浮孵育6.酶特异性对照实验用酶活性抑制剂采用无底物的孵育液过固定或加热用针对目标酶的激活剂改变孵育液底物选择最适PH酶细胞内的定位差异（六）各步骤注意问题7.孵育后操作光镜:酶孵育后进行后固定脱水封片,镜检电镜:孵育后,后固定脱水超薄切片后染色电镜检查（六）各步骤注意问题8.人为产物及其原因酶或与检测有关物质的扩散最终反应产物的扩散吸附现象反应阴性（六）各步骤注意问题三.显示酶的组织化学方法（一）金属离子沉淀法一般用于显示磷酸酶1.钙钴法β-甘油磷酸钠磷酸酯+Ca++磷酸钙磷酸钴硫化钴（黑色沉淀）酶底物PRP（磷酸）+某金属金属置换显色与底物混合液某金属离子结合AKPCo++硝酸钴硫化胺酶2.Gomori硝酸铅法β-甘油磷酸钠磷酸酯+铅磷酸铅硫化铝（黑色沉淀）PRP（磷酸）酶底物与底物混合液中显色反应金属离子结合ACP硫化胺酶直接沉着（二）偶氮偶联法（偶氮色素法）1.原理底物混合液PRP与不溶性重氮盐结合偶氮色素2.方法同时偶联法后偶联法酶偶氮偶联3.常用底物萘酚AS-BI萘酚AS-D萘酚AS-MX萘酚AS-TR常用重氮盐坚牢兰RR坚牢兰B坚牢红RC坚牢红TR坚牢紫B六偶氮副品红六偶氮新品红4.举例α-萘基磷酸钠磷酸氢二钠+α-萘酚α-萘酚+坚牢兰偶氮染料沉淀5.应用可显示ALPase,ACPase,酯酶,转肽酶,肽酶,β-葡糖苷酶等磷酸酶(三)联苯胺色素法用于显示过氧化物酶原理:无色联苯胺有色联苯胺联苯胺褐酶脱氢(四)四唑盐法用于显示氧化酶和脱氢酶原理:四唑盐或双四唑盐氢离子与与底物混合液无色四唑盐结合红色或兰色的沉淀脱氢酶+2H被还原常用四唑盐种类三苯四唑氯化物TTC蓝四唑盐BT新四唑盐NT四唑氮蓝NBT四氮四唑盐氯化物TNBT(五)靛蓝反应原理:底物被酶分解为二个初级反应产物,其中之一可在一定条件下形成不溶性的靛蓝应用:可显示胆碱酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异性酯酶例如：吲哚酚酯吲哚酚+RCOOH吲哚酚靛蓝（兰色沉淀）酯酶+水氧化作用O2四.酶组织化学的应用1.了解组织、细胞的代谢活动2.细胞类型的判断3.了解细胞定位4.用于肿瘤的研究5.用于免疫组化和杂交组化的显示手段