薄层色谱法-补充

薄层色谱法（TLC）薄层色谱法概述：薄层色谱法简称TLC，是在50年代从经典柱色谱法和纸色谱法基础上发展起来的一种色谱技术。60年代后，人们对薄层色谱法的标准化、规范化及扩大应用等方面进行了许多工作，使该方法日趋成熟。薄层色谱法工作的过程是这样的：首先将要分离的混合物点在用固定相均匀涂布的薄板的一端；然后将薄板的这一端浸入流动相，在流动相浸湿薄板的过程中，样品随着流动相被展开，不同的组分随流动相以不同的速度向前移动，最终保留在薄板上的不同位置，从而达到分离的目的；再用适当的方法对不同的组分进行检测，就可以定性或定量的对样品作出分析。此时的固定相被称为载体或吸附剂，而流动相被称为展开剂，被展开的样品叫做斑点。薄层色谱的特点：灵敏度及分辨率高、分离快速、操作方便、同时分离多个样品、样品预处理简单、设备简单。由于这些特点，薄层色谱在实际工作中的应用十分广泛。由于通常用薄层色谱分析法进行定量分析的过程中，薄层扫描仪是最为重要的，因此对它进行略详的介绍。薄层扫描仪的基本结构及主要功能基本是相同的，每台仪器都包括光源、分光器、检测器、数据处理及信号输出几个部分。典型的检测方法是吸收检测法，其基本测定原理为，用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点或被斑点反射的光束，根据光束被斑点吸收后强度的变化来确定组分的含量。薄层色谱法的优点特别适合我国国情，已成为许多实验室不可缺少的分离手段。该方法在科研、教学、临床、生产等各个领域中广泛应用，分离对象也无所不包。目前它正向联用的方向发展，如薄层色谱--气相色--质谱联用，或都薄层色谱--红外光谱等的联用。医药工业薄层色谱在医药工业中有很广泛的应用，特别应用在中草药、中成药的成分分析和合成药物分析。临床医学在临床医学中，它主要用于对生物样品和有毒的物质进行分析。环境科学薄层色谱可以用来进行农药及农药残留分析，或都对有毒金属、多环芳烃进行检测。食品化学食品添加剂的安全性问题已婚经越来越多的得到关注，用薄层色谱对食品添加剂进行分析是一种简单有效的方法。化学化工薄层色谱在化学、化工方面也有很多应用，例如对高分子材料的助剂、填料等进行分析。1.方法原理薄层色谱是一种微量分析的分离过程，它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上,利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处，在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。(1)流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相。(2)样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极-（诱导）-偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力程度不同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行。基于这点，TLC系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配。用显色试剂处理，许多组份可在日光或紫外灯光下检视。色谱可用肉眼或使用光密度计和照相机记录或影像系统方法来评价。2.薄层板2.1手工自制板2.1.1玻璃板的要求:用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁、平整，最好使用厚薄1~2mm的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层板，玻璃板需洗净至不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用。玻璃板反复使用时，应注意经常用洗液及碱液清洗，保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求2.1.2制作方法:除另有规定外，将1份吸附剂加适量的水（如1份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研杵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆,立即倾入涂布器中,均匀地向前推进涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的规定操作涂布;涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干,再在规定的温度(一般为105℃~110℃)下烘约30分钟活化,贮于干燥器中备用。薄层板的厚度一般为0.25~0.5mm.。2.2商品化供应的预制板和高效板2.2.1板的尺寸20x20cm10x20cm20x10cm10x10cm图1不同的板尺寸TLC/HPTLC预制板有不同的规格供应。常用的尺寸为20x20，10x20，20x10，或10x10cm。使用的规格取决于TLC或HPTLC的类别和样品的数目。2.2.3TLC/HPTLC板的预洗及活化一般来说，色谱板应用溶剂如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更强的洗脱溶剂的混合物进行预洗。具体操作可通过空白色谱展开来实现。色谱板预洗完后,应在105C加热1小时进行干燥，再在室温下置放至少2小时（需采取保护措施以防止实验室空气中的污染物重新附着在其上面，如放置在空的干燥器中）。3.样品点样3．1点状点样和条带状点样每次点样前，TLC/HPTLC板应在正常光线下和紫外灯下用肉眼检查薄层的损伤情况和杂质，只有无损伤、清洁的TLC/HPTLC板方可使用。样品可进行点状或条带状点样。要想获得最佳的薄层分辨率，必须保证移行方向中的起点要小，常规的TLC薄层点状点样每次点0.5至5微升，相比之下，HPTLC薄层最大点样量为1微升。点样量较大的样品可使用自动化装置点样，喷雾成条带状是一种可以点样量大而同时又能促成最有效分离的点样方法。在常规操作过程中，人工点样一般使用微量毛细管（0.5/1/2/3和5µl），点样时毛细管必须完全充满和完全排空，要以垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，不要损伤薄层，受损的薄层会导致溶剂不规律地流动而在色谱上产生失真的TLC谱带。人工点样建议使用Nanomat。它点样位置精确并安全，使薄层免于受损。用适当的介质干燥Nanomat也可用作单个量的多次点样。样品体积大于5µl，通常用如Linomat或AutomaticTLCSamplerIII的方法用氮气喷雾成窄条。若（就是）要求点状样品点样，Linomat和AutomaticTLCSamplerIII应将条长度设定在1至2mm。3.2样品点样位置起点的最佳位置如图2和3所示。起点下缘的最小距离b取决于溶剂量。两个起点之间的距离c必须令平行移行的主成份不会相互触及。点状点样时原点的直径应小于或等于3mm（高效板原点的直径应更小）,条带的长度d由点样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来决定。到板侧边的距离a必须足够大以避免分离区失真变形（见图2和3）。图2：斑状样品点样的一般点样位置（a=20mm,b=10mm,c=两起点之间的距离。）图3：条状样品点样的一般点样位置（a=20mm,b=10mm,c=两起点之间的距离，d=条的长度）4.层析4.1展开室4.1.1直立式双槽展开室具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点。4.1.2水平展开室可以从薄层板的两侧向中间水平地展开，这样可使一块薄层板所承受的样品个数比常规上行展开的薄层板增加一倍。4.1.3自动展开室(AMD)可使用五种溶剂对同一薄层进行多次展开，自动控制预饱和、展开方式、展开距离和干燥条件，分离效率比传统方式提高三倍（可在80mm之内分离40种成分），符合GLP/GMP要求。4.2.溶剂使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”，溶剂组成采用体积量比（如正丁醇-冰乙酸-水=4：1：1，V/V/V），或者绝对量（如18ml甲苯+2ml甲醇）。其总量应足以使TLC/HPTLC板的浸入深度约为5mm。展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用,如需分层，则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层），备用。在双槽展开室中，对每种类型和规格和层析板，每槽通常注入的溶剂数量如表3。表3：板的规格板的尺寸（宽×高）溶剂量预制板20×20cm20×10cm10×10cm25ml15ml8ml高效板20×10cm10×10cm10ml5ml4.3展开室状况溶剂的蒸气相在展开箱中也参与色谱展开而形成三维的层析过程，展开箱的气体空间在层析过程中起着重要的作用。以下有四种常见的情况（A、B、C、和D）。4.3.1方法A（展开室不饱和）方法A的特点：不呈饱和状态无滤纸只有一个槽内有溶剂每个展开室只有一块TLC/HPTLC板薄层向里（如图4）图4：有溶剂和TLC/HPTLC板的双槽展开室图5：有溶剂和TLC/HPTLC板的双槽展开室方法A的操作程序：TLC/HPTLC板在倒入相应量的展开剂后立即放至展开室中，薄导层板应垂直地竖放在溶剂中，薄层向里，展开室盖上后层析立即展开。对某些分离过程，在产品专用方法中有明确的说明时，另一槽可盛放一些调节液体（乙酸，浓氨水等）。4.3.2方法B（部分饱和，无滤纸）方法B的特点：不完全饱和无滤纸在两个槽内盛放溶剂每个展开室只有一块TLC/HPTLC板薄层向里（如图5）方法B的操作程序：将展开剂倒入至两个槽内，盖上盖子，置放15分钟后，将盖子移向一边，TLC/HPTLC板涂层向时地竖放入溶剂中，盖上展开室，让TLC/HPTLC板开始展开。对某些分离过程，在产品专门方法中有明确的说明时，另一槽可放置调节液体（乙酸，浓氨水等）。4.3.3方法C（展开室饱和，有滤纸）方法C的特点：用放入滤纸使饱和（至少30分钟）在两个槽内盛放溶剂每个展开室只有一块TLC/HPTLC板薄层面向滤纸（如图6）图6：有溶剂、滤纸和TLC/HPTLC板的双槽展开室图7：有溶剂，滤纸和TLC/HPTLC板的双槽展开室方法C的程序：将展开剂倒入至两个槽内，将与展开室相同型号的滤纸（如CAMAG序号022.5243）用规定量的溶剂湿润后贴在玻璃展开室正面，盖上盖子，放置30分钟（标准时间），然后将盖子移向一边,TLC/HPTLC板薄层面向着滤纸竖放入溶剂中，盖好展开室让板进行层析。对某些分离过程，在产品专用方法中有明确说明时，另一槽可置放调节液体（乙酸，浓氨水等）。4.3.4方法D（展开室饱和，薄层预稳定）方法D的特点：薄层预稳定，放置滤纸使展开室饱和溶剂量增加一倍每个展开室只有一块TLC/HPTLC板薄层面向滤纸(如图7)方法D的程序：将展开剂倒入至一个槽内，将与展开室相同型号的滤纸（如CAMAG序号022.5243）用规定量的溶剂湿润后贴在玻璃展开室正面，另一槽空着,TLC/HPTLC板薄层面向滤纸地置放在空槽中，除非产品专用方法另有规定，15分钟（标准时间）后，稳稳地倾斜使足够量的溶剂移至有TLC/HPTLC板的槽中（图8，只有用20x20和20x10cm的展开室才能这样做；若为10x10cm的展开室，溶剂需从外部用移液管或类似器材实现转移）。图8：倾斜的双槽展开室图9：有溶剂，滤纸和经预稳定TLC/HPTLC板的双槽展开室，层析开始4.4参数4.4.1温度薄层色谱分析一般在室温中进行。对这过程，温度在20-25ºC算不上是临界值。在这过程，中无短期的温度波动才是更为重要（避免抽风）。展开室应放置在无直射阳光和不通风处。温度波动对层析结果不利，故将展开室放在靠近窗口或热源处是欠妥的。4.4.2空气湿度空气湿度极高或极低主要影响有非极性溶剂体系的无机涂层。相对空气湿度高于70-80%会影响薄层钝化，使Rf值增加。样品点样后，TLC薄层可置放在适当的硫酸和水的混合物的上面不少于30分钟，调整至指定的相对湿度。有关这方面的更多资料可从HPTLCVario系统的操作手册中获得。另一方面，在样品点样前，TLC/HPTLC板可在105ºC再活化30分钟进行干燥。然后薄层必须用一块玻璃板保护起来，只有起点区露出以便于样品点样。若空气太干燥，可在干燥器中将TLC/HPTLC薄层置于水的上方以达到所要求的状况。确定合适的层析条件的有效方法（用规定的湿度，溶剂蒸汽或溶剂调整使薄层达到要求的状况）是使用HPTLCVario体系。控制相对湿度用的硫酸溶液下表：相对湿度所需硫酸浓度（V/V）硫酸（ml）+水（ml）32%47%42%58%65%72%88%68.010050.010057.010039.510034.010027.510010.81005．层析后衍生作用若层析板分离的物质肉眼看不见又不能被紫外光活化，需加试剂方能显色或发射荧光者，则需使用适当的试剂浸渍或均匀喷洒于薄层板面上，直接观察或加热显色后观察。