蛋白多克隆抗体的制备

***蛋白多克隆抗体的制备：试剂:生理盐水(或PBS)弗氏完全佐剂(Freund’scompleteadjuvant，FCA)弗氏不完全佐剂(Freund’sincompleteadjuvant，FIA)二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2%NaN3免疫原：**********************。(免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。)动物选择:如兔子:兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。免疫1.免疫前与兔耳朵耳缘处静脉采血作为阴性对照。或备用几只兔子用于制备对照抗原2.第一次抗原免疫使用生理盐水稀释免疫原，然后与FCA进行1:1混合。抗原和FCA完全混合形成稳定的乳剂（如使用100ml的FCA与100ug纯化后的免疫原再加生理盐水至2ml），将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答.3.第2,3,4次抗原免疫使用生理盐水稀释免疫原，然后与FIA进行1:1混合。抗原和FIA完全混合形成稳定的乳剂（如使用100ml的FIA与100ug纯化后的免疫原再加生理盐水至2ml），将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答.注：免疫注射共四次，两周一次，八个星期后，在被免疫的兔子耳缘静脉采血，与阴性对照量相同,每次免疫后7～14d抽取少许静脉血，分离血清，以备检测免疫效果。于第4次免疫后14d试血4.将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，在-20°C保存.血清的纯化：采用饱和硫酸铵方法纯化抗血清［４］，具体步骤：①取５００ｍＬ蒸馏水，加热至８０℃，将４００ｇ硫酸铵（分析纯）溶于蒸馏水中，加热搅拌使其溶解，待降至室温，取上清液即为饱和硫酸铵，用浓氨水调节ｐＨ至中性；②将抗血清溶于ＰＢＳ中，然后逐滴加入制备好的饱和硫酸铵溶液中，使其充分混匀，４℃冰箱静置３０ｍｉｎ，然后１００００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ；③取上清，再加入饱和硫酸铵溶液中（调至终浓度为５０％饱和硫酸铵溶液），低温离心并弃上清；④在沉淀中加入ＰＢＳ使其溶解，再加入饱和硫酸铵溶液，使之成为３３％的浓度，４℃冰箱静置３０ｍｉｎ后，低温高速离心，弃上清，重复该步骤３次后，用适量ＰＢＳ溶解沉淀，并装入透析袋内，透析２４ｈ，中途数次更换透析液。透析后，取样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测纯化效果，并确定抗血清浓度，并调整至１ｍｇ／ｍＬ.纯化抗体的检测:1:抗体按1：100稀释（用正常兔血清做阴性对照），采用40点组织芯片（上海芯超生物技术有限公司），用常规S-P法脱蜡，水化，抗原修复，用正常山羊血清封闭液，滴加一抗50ul，室温静置一小时后洗涤，加二抗40-50ul，室温静置后洗涤，DAB显色5-10min，洗涤，脱水，透明，封片，镜检。2:间接ＥＬＩＳＡ方法检测抗血清效价５μｇ／ｍＬＰＲＶ抗原包被９６孔酶标板，１００μＬ／孔，４℃冰箱孵育过夜，弃去孔内液体，然后用含０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０的ＰＢＳ洗板３次，３ｍｉｎ／次，每孔加入５％脱脂奶粉封闭２ｈ，洗板３次，５ｍｉｎ／次，然后每孔分别加入不同稀释度的抗血清（１００μＬ／孔），同时用未免疫的兔血清相同处理后作为阴性对照，３７℃孵育２ｈ，洗板３次，５ｍｉｎ／次，加１∶５０００稀释的羊抗兔酶标二抗孵育１ｈ，显色并用酶标仪测定吸光度。计算Ｐ／Ｎ值，以Ｐ／Ｎ≥２．１判定为阳性，将呈阳性反应的最大稀释度作为抗血清的效价。