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培养的细胞(定量):⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。⑶12000g离心,4℃,5min。⑷将上清转移至另一只EP管中并编号置于冰上检测浓度⑸取少量上清进行定量。(上清量随细胞量与裂解液量而定接种细胞4*10^5150ul裂解液则可以取1ul)1.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mgBSA)中,充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用,也可以-20℃长期保存。2.取适量25mg/ml蛋白标准,稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取蛋白标准,加入稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见,也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。3.根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。例如5mlBCA试剂A加试剂B,混匀,配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。4.各孔加入200ulBCA工作液,5.加适当体积样品(上清量随细胞量与裂解液量而定接种细胞4*10^5150ul裂解液则可以取1ul)到96孔板的样品孔中,加标准品稀释液(实验用超纯水代替)到20ul。6.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的标准品孔中,加标准品稀释液(实验用超纯水代替)补足到20ul。37℃放置20-30分钟。⑹将所有蛋白样品调至等浓度(1.5~3.5ug/ul)保证加样为40ug左右,充分混合沉淀后加5×loadingbuffer稀释为1×后100℃,5min。直接上样最好,剩余溶液(溶于1×loadingbuffer)可以低温储存,-70℃一个月,-20℃一周,4℃1~2天。THERMO多功能酶标仪操作1板进2孵育37℃(勾选到温度时计时)25min3振动5s4暂停5s5光度测量562nm布局标准样品结果定量曲线拟合图片复制粘贴到word保存成图片到桌面拟合后的结果在excel中打开插入图片保存//ewhn名称+日期删除桌面文件后登记关机02550100200300400500
本文标题:蛋白样本制备
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