蛋白质分离技术

蛋白质分离纯化的条件蛋白质是一类结构复杂的生物大分子，在细胞和抽提液中蛋白质的性状也不尽相同，离开天然环境，蛋白质分子变得极不稳定，因此从正常生物材料中提取各种蛋白质均需要特定的条件。(一)缓冲液缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。各种缓冲液原则上都可用于蛋白质的分离纯化，但具体选择何种缓冲液要视分离纯化的目的物性质及所采用的纯化技术而定，例如缓冲液中的无机成分(磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐等)可以与酶或底物反应,从而影响酶的活性；大多数动物细胞在37℃生理状态下的pH值是7.0-7.5之间，因此应选择相应的缓冲液；对凝胶过滤方法，大多数缓冲液均可适用；离子交换层析中的阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选Tris缓冲液，阳离子交换层析，阴离子缓冲液首选磷酸缓冲液。在选择缓冲液时，最好对pka相近的一些缓冲液进行比较试验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用，影响蛋白质的分析分离。(二)盐、金属离子和整合剂大多数蛋白质如球蛋白，在稀盐溶液中才能溶解，因此应采用含盐(氯化纳)缓冲液。通常用0.1-0.2mol/LNaCI或KCl来模拟生理状态下的离子强度。某些金属离子特别是二价金属如Ca2+、Mg2++等往往是酶的组成部分，失去金属离子其活性会大大下降,如果这些确是我们所需要保护的，则应避免其与缓冲液中的成分形成复合物。但有些蛋白质含疏基,而这些疏基是活性所必须的，为减少金属离子对活性的影响，可以在缓冲液中加入特异金属离子的螯合剂(Chelate)除去这些金属离子，如Zn2+的螯合剂为邻二氮杂菲；Ca2+的螯合剂为乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)；重金属及其它金属离子为乙二胺四乙酸(EDTA)。(三)还原剂细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎，由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活性，如巯基蛋白，一般应加入一些还原剂。如抗坏血酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)可以有效防止上述的氧化过程。(四)去垢剂去垢剂为双极性分子,可在水中溶解。除胆酸盐外,去垢剂分子通常是由线性或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成。去垢剂的一个重要特性就是可以形成分子团结构。当膜蛋白与去垢剂分子接触时，膜蛋白的疏水区或穿膜区被去垢剂分子覆盖，成簇的去垢剂分子将亲水性头部向外，使其能与水溶性缓冲液相溶。另外,去垢剂形成的微胶粒分子量对于透析、凝胶过滤层析、非变性电泳都是非常重要的。为了使蛋白质更好的溶解和保持蛋白质的活性，需选择合适的去垢剂。如溶解膜蛋白可选择TritonX-100；1-3%浓度的TritonX-100能使许多蛋白质活性保持不变；Tween-20通常用在固相免疫细胞化学反应(如ELISA、RIA、免疫印迹等)中用来阻断非特异性蛋白之间的相互作用；SDS等离子型去垢剂由于可使蛋白质以单体形式被分离，常用于蛋白质分子量的测定；CHAPS常用于离子交换层析和等电聚焦电泳,含有CHAPS的蛋白质溶液可以冰冻保存。如果用不同的去垢剂均不能获得较好的结果,可以探索多种去垢剂混合使用。（五）蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时，会释放出多种蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速被抑制才能保持蛋白质不被降解。由于大多数蛋白酶的最适pH在3-5或更大，因此可以采用低pH条件降低蛋白酶的活性，但最重要的是加入蛋白酶抑制剂。不同类型的蛋白酶可选用不同的蛋白酶抑制剂，有时需要几种蛋白酶抑制剂混合使用。蛋白质的环境因素及保存1、表面效应蛋白质的稀溶液易于使蛋白质失活，这可能是由于玻璃容器表面效应的结果。这一作用可以在溶液中加入高浓度的其它蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)来防止；另外玻璃表面非特异的吸附可损失大量的纯化蛋白（5cm2的玻璃表面可吸附1μg蛋白）,在溶液中加入BSA也可大大降低这种非特异性的吸附作用。通常在酶活性测定中至少加入0.1mg/mlBSA，而在蛋白质储存液中则加入10mg/ml的BSA。2、温度除了极少数酶是在低温条件下失活,称为“不耐低温酶”,如线粒体ATP酶，大多数酶在温度高时会失活。蛋白质也一样，在温度超过30-40℃时，蛋白质变得极度不稳定，大多数会由于热变性而失去活性，蛋白质在低温时其半衰期可延长。3、储存蛋白质短期保存(1天至1周)时，可以溶液状态在4℃保存。如需长期储存(超过1周)，根据需要可以采取不同的方式，如在硫酸铵溶液中以沉淀悬浮的方式于4℃保存；或者用硫酸铵沉淀蛋白，离心后在液氮中冷冻，然后低温保存；最好的方法是将蛋白质以冻干的粉末保存。以冰冻干燥的失水状态保存蛋白质对许多蛋白质是有利的，但冻干对于一些蛋白质会部分失去活性。另外，在保存的蛋白质中需加入甘油、白蛋白、白明胶、二甲基亚砜等惰性稳定剂，由于它们能降低溶液的极性，造成疏水环境，有利于蛋白质的稳定。