蛋白质棕榈酰化修饰及其研究方法

燕京理工学院药物合成反应论文蛋白质棕榈酰化修饰及其研究方法XX化工与制药专业化药XX班学号XXX指导老师XX老师摘要蛋白质棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质共价修饰的一种重要形式，对象主要是胞质蛋白质，对蛋白质功能产生多重影响。近年来由于相关新技术引入，对蛋白质棕榈酰化主要修饰酶及其对靶蛋白功能调节方面的研究已渐成为新热点。本文主要对近几年来蛋白质棕榈酰化修饰及其研究方法作了综述。关键词：棕榈酰化修饰蛋白质酰基转移酶DHHC蛋白燕京理工学院药物合成反应论文前言人类基因组计划揭示了基因组的结构,但对多数基因功能仍知之甚少。基因功能通常通过蛋白质实现，因此蛋白质组研究成为近年来生命科学研究的重点领域。蛋白质具有生物活性之前要经过基因转录、转录后加工、翻译、翻译后加工及转运等多个复杂过程。其中脂质化修饰是一种重要的翻译后修饰形式，目前已知约有5种脂质共价修饰形式，其中100多种蛋白质发生棕榈酰化修饰，赋予蛋白质极其复杂的生理功能[1]。燕京理工学院药物合成反应论文1．蛋白质棕榈酰化修饰及其相关蛋白质1．1蛋白质棕榈酰化修饰30年前蛋白质棕榈酰化修饰形式被发现，然而对其修饰酶的研究最近十年才有所进展。在酿酒酵母中首次发现蛋白质酰基转移(PAT)，由5O个氨基酸残基组成，其序列特征为锌指样DHHC-CRD(半胱氨酸残基聚集域)，类似Cys2His2锌指模体，常位于跨膜域TM2和TM3之间。但是至今仍未明确棕榈酰基团修饰识别模体，推测其保守序列为C-x2C-x9-H-Cx2-C-x4-DH-H-C-x5C-x4-N-x3一F(x为任意氨基酸)[2]。根据介导和连接方式不同，棕榈酰化修饰有三种方式和两种类型[2,3,4]。三种修饰方式包括：(1)PAT介导棕榈酰基转移，为目前主要研究方式；(2)棕榈酰辅酶A介导转移；(3)棕榈酰辅酶A为辅酶的转移蛋白质介导转移。两种类型包括：(1)N型，通过酰胺键连接半胱氨酸(Cys)，(2)S型，通过硫脂键连接Cys。S型较为多见，可分为四个亚类：修饰位点位于或临近跨膜域；修饰位点为N-或C-端Cys；酰化依赖C-端CAAX盒异戊烯化修饰；酰化依赖N．端SH4结构域豆蔻酰化修饰。与异戊烯化、豆蔻酰化、胆固醇脂化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI)四种修饰形式不同，棕榈酰化由PAT、硫酯酶(PPT)动态调节蛋白质酰化和脱酰化，具有可逆性，该修饰还常常与其他修饰形式共同修饰蛋白质[5,6]近几年，相关蛋白质陆续被识别发现。1．2DHHC蛋白目前将富含DHHC结构域的蛋白质称为DHHC蛋白，它们组成DHHC蛋白质家族。多数家族成员具有PAT活性，而且棕榈酰化主要修饰具有DHHC—CRD的蛋白质，所以多种DHHC蛋白既是酶又是底物[2]。0hno等[7]荧光观察发现，人类和酵母DHHC蛋白主要位于细胞内质网和／或高尔基体，其中少数蛋白质如Pfa5、DHHC-5位于细胞膜，还有少数如Vac8、Pfa3位于酵母液泡。人类DHHC蛋白普遍存在，其中许多蛋白质呈组织特异性分布，在器官发生晚期合成，发育组织表达高，而成熟组织表达低[2]。1．3酵母的棕榈酰化蛋白质最早在酵母中发现j个促进棕榈酰化修饰的蛋白质是Ras功能效应子(Erf2)，锚蛋白重复域蛋白(Akr1)和SNARE家族成员Ykt6，但没有确定它们具有PAT功能；随后经证实Erf2-Erf4/Shr5蛋白质复合体，Akrl和Swfl具有PAT燕京理工学院药物合成反应论文活性[2]。随着技术完善，研究发现的棕榈酰化蛋白质不断增多，Roth等[8]又发现35个棕榈酰化蛋白，包括Ras，Rho，SNARE家族成员和氨基酸通透酶类(AAP)等。1．4哺乳动物和其他生物的棕榈酰化蛋白质随着技术进步，研究范围从酵母扩展到哺乳动物。Fukata等[9]筛选人鼠基因库，得到23个D删C基因，编码23种不同DHHC蛋白。其中较明确的是DHHC3/GODZ、DHHC9/GCP16、DHHC-15、HIP14，DHHC17，相应底物为GABAAy2受体亚单位、H—Ras/N-Ras、PSD-15、亨廷顿蛋白[2,7]。Fernandez-Hemando等[10]发现，人内皮细胞膜上有5种DHHC蛋白，为DHHC2、DHHC3、DHHC7、DHHC8、DHHC21。Zhang等[11]研究的hAPH2是DHHC16蛋白，且具有5种亚型。另外，Lopez等[12]发现，冠状病毒组装必需的包装蛋白质E通过长末端疏水域C-端保守位点Cys酰化修饰成为棕榈酰化蛋白。2．棕榈酰化对蛋白质功能的影响100多种蛋白质(包括受体、配体、信号转导子)[1]棕榈酰化修饰后调节蛋白质活性、稳定性、膜融合及胞内转运、介导蛋白质定位特定亚细胞器、参与调节多种细胞信号通路、介导蛋白质一蛋白质、蛋白质一脂质相互作用[2]。棕榈酰化蛋白质参与组成各种细胞膜脂质结构域，促进自身或其他蛋白质定位膜脂筏(富含胆固醇，鞘磷脂和GPI微结构域)中；还与特定疾病相关，参与肿瘤发生发展[5,8]DHHC蛋白在细胞信号通路中发挥重要作用，Das等[15]发现，POTE蛋白N-端CRD含3～4个富集Cys重复序YlJ(CRRs)中成对Cys棕榈酰化，介导其定位质膜胞质面，参与不同信号转导途径。Yang等[14]发现，Gao经酰化修饰调节GDP／GTP转换，影响寡聚体解聚，调节其偶联信号转导的开-关作用。3．蛋白质的研究方法3．1棕榈酸脂代谢标记法方法是最早研究棕榈酰化的方法，通过监控动物体内3[H]标记棕榈酸脂，脉冲追踪分析检测棕榈酰化率.鉴于蛋白质分离和质谱技术的不断发展，特别是联合多维液相层析技术能极大提高蛋白质鉴定通量，更好的检测修饰位点[17]。虽然可以得到修饰位点，但是质谱技术检测时蛋白质先要消化为多肽，多种因素影响混和液离子密度，因而不能区分2个单不饱和脂肪酸和1个双不饱和脂肪酸，导致多肽丢失，修饰位点不精确[3,6]。燕京理工学院药物合成反应论文3．2脂肪酸酰基转换标记化学法-ABE法近年来普遍应用的方法，较棕榈酸脂代谢标记法更易于检测。此方法高度敏感，特别是巯基特异复合物标记，检测灵敏度较高，不仅应用于活细胞，还可从冻存组织中提取蛋白质标记并且能定量分析，也可联合应用探针法标记和质谱技术分析。尽管如此，此方法仍有缺点.3．3类似物和抑制剂的应用利用目前已知棕榈酰化蛋白质cDNA和相应抗体，以上方法为基础，Resh等[3]应用棕榈酸脂类似物如l6一碘代棕榈酸标记，更易于降低代谢相互转化作用，短时即可探测γ射线，再联合MALDI-TOF质谱技术就可定量，同时应用以下三种方式改变或抑制修饰位点验证特异性，并进行功能研究及评价重要性。(1)突变修饰位点Cys残基，突变体克隆和野生型分别转染细胞，比较二者功能差异。此方法缺点是外源转入减弱内源蛋白质功能，外源蛋白质过表达而不能直接检测内源蛋白质。(2)应用2-BP等化学试剂抑制修饰。2-BP较之其它类似物多效和特异，并保持Cys完整性从而检测内源蛋白质。(3)应用软脂酰硫脂酶(APT1)脱棕榈酸化和其他脂肪酸如油酸盐等多不饱和脂肪酸代替棕榈酸脂，改变蛋白质高级结构从而研究功能改变，如13一氧化棕榈酸酯改变了棕榈酰化蛋白质膜脂筏结合力，从而对修饰蛋白质功能更深入了解。Kostiuk等[18]州应用叠氮棕榈酸脂类似物，得到鼠肝脏线粒体中21种棕榈酰化蛋白质，发现修饰后抑制各种酶，导致肥胖相关疾病代谢缺陷。突变癌蛋白质如Ras、Src相关酪氨酸激酶的酰化位点能阻止细胞恶变，因此特异性PAT抑制物具有抗肿瘤作用。许多棕榈酰化蛋白质与疾病和肿瘤密切相关，通过类似物和抑制剂进行干扰，应用于疾病和肿瘤的治疗。燕京理工学院药物合成反应论文结论蛋白质棕榈酰化主要修饰酶的功能研究领域不断扩大，酶动力学的研究更加迫切；由于缺乏明确的蛋白质修饰位点，大大阻碍了蛋白质功能研究；单一技术还不能纯化分离特异棕榈酰化蛋白质，需要联合各种方法提高检测率。目前在这一领域的研究还相当局限，从酵母到哺乳动物筛选得到的棕榈酰化蛋白质也只有100多种，各种PAT的功能及其底物仍不明确，研究者们还需不断致力于棕榈酰化蛋白质定性定量分析和功能探索，需要更加有效及准确特异的研究方法。相信深入研究不仅可以丰富对蛋白质组学的认识，还可对某些疾病诊断治疗和肿瘤治疗等具有深远意义。燕京理工学院药物合成反应论文参考文献[1]ReshMD．SciSTKE，2006，2006(359)：re14[2]MitchellDAeta1．JLipidRes，2006，47(6)：1118—1127[3]ReshMD．Methods，2006，40(2)：191—197[4]RothAFeta1．Methods，2006，40(2)：135—142[5]LinderMEeta1．NatRevMolCellBiol，2007，8(1)：74．84[6]BuddeCeta1．Methods，2006，40(2)：143—150[7]OhnoYeta1．BiochimBiophysActa，2006，1761(4)：474—483[8]RothAFeta1．Cell，2006．125(5)：1003—1013[9]FukataYeta1．Methods，2006，40(2)：177—182[10]Fernandez—HernandoCeta1．JCellBiol，2006，174(3)：369377[11]ZhangFeta1．BiochimBiophysActa，2006，1759(11—12)514．525[12]LopezLAeta1．JVirol，2008，82(6)：3000—3010[13]DasSeta1．BiochemBiophysResCommun，2007，363(3)751—756[14]YangHeta1．MolMembrBiol，2008，25(1)：58—71[15]RaymondFLeta1．AmJHumGenet，2007，80(5)：982．987[l6]GalluzzoPeta1．EndocrRelatCancer，2007，14f1)：153．167[17]DrisdelRCeta1．Methods，2006，4O(2)：l27．134[18]KenworthyAK．Methods，2006，40(2)：198．205