蛋白酶的发酵及其活力测定

一、实验目的1、了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线2、了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理3、掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法二、实验仪器与器材1、器具：UV1000分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪、吸管、离心管、枪头、摇床、培养基等。2、试剂：福林试剂、0.4mol/L的碳酸钠溶液、0.4mol/L的三氯乙酸、0.5mol/LNaOH溶液、1mol/L和0.1mol/L盐酸溶液、硼酸缓冲液(pH=10.5)、10g酪素溶液、100ug/mLL--酪氨酸标准溶液3、材料：菌种（产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种）、酶源（蛋白酶发酵液）、产蛋白酶发酵培养基、蛋白酶活力检测试剂、牛肉膏蛋白胨培养基、酪素培养基三、实验原理将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵，30-32℃震荡培养48h，将发酵液过滤或离心，取清夜检测蛋白酶活力。采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。四、实验步骤与内容4.1培养基的配置4.1.1配制牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、水1000ml、pH7.0~7.2、121℃灭菌20min。4.1.2配制酪素培养基牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/LNaCl4-5g/LPH7.2—7.4先将酪素用少量2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解（10-15min），补足1000mL蒸馏水，加入其他成分，调PH分装灭菌。4.1.3活化并得到对数期种菌种：将筛选好的并保藏在冰箱里中的未知的产蛋白酶实验菌接种2环于150ml液体发酵培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的250ml三角瓶中，30-32℃摇瓶发酵，在摇床里30℃震荡培养16到18小时，目的在于活化菌种并得到对数期菌种。在培养瓶中进行发酵。4.2获取不同培养时间发酵液4.2.1整点8:00时，准时接入已经活化好的对数期菌种，用1000ul的移液枪吸取5ml的对数期菌液加入到发酵瓶A中（液体为酪素培养基），剩下的对数期菌种菌液置于4℃冰箱种中保藏于。并同时将A号发酵瓶放到摇床中，继续30℃震荡发酵。在直到20:00时将放在冰箱中保藏的菌种液（活化的对数期菌种）取出5ml接种到B号发酵瓶中。并放在30℃的摇床中继续发酵。4.2.2发酵过夜之后，在8：00时，将放在冰箱中保藏的菌种液（活化的对数期菌种）取出5ml接种到C号发酵瓶中。立即从A、B、C号瓶移取发酵液5ml到对应的离心管中。A瓶取样分别对应的编号是12、13、14、15、16、17、18对应培养时间为24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h。B瓶取样分别对应的编号是6、7、8、9、10、11对应培养时间为12h、14h、16h、18h、20h、20h完成全部取样。C瓶取样分别对应的编号是0、1、2、3、4、5对应培养时间为0h、2h、4h、6h、8h、10h。并且全部放到4度冰箱封存。4.3配制蛋白酶活力检测试剂：4.3.1福林-酚试剂：向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4.2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。4.3.20.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。4.3.30.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。4.3.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L4.3.5盐酸溶液c(HCI)=lmol/L及0.lmol/L4.3.6磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na,HP0,·12H,0)6.02g和磷酸二氢钠(NaH,PO,·2H,0)0.5g，加水溶解并定容至I000mL4.3.7l0g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.00lg，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。4.3.8100μg/mL酪氨酸溶液：精确称取0.100g酪氨酸，逐步加入lmol/L盐酸6ml溶解后，用0.1mol盐酸定容至100mL得1mg/ml酪氨酸溶液，取此溶液10ml，用0.1mol盐酸定容到100ml,放入4度冰箱中保存。4.4标准曲线的制作按照如下添加量进行添加：管号酪氨酸标准溶液的浓度ug/ml取100ug/ml酪氨酸标准溶液的体积ml取去离子水的体积ml加0.4mol/L的碳酸钠溶液的体积ml加福尔马林的体积ml测定OD680值000.01.05.001.001100.10.95.001.002200.20.85.001.003300.30.75.001.004400.40.65.001.005500.50.55.001.00加完之后，置于40+0.2水浴中显色20min，取出，用分光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的对照管为空白，分别测定其吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值，K=95~100。4.5产蛋白酶菌的生长曲线的绘制（1）将编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18的离心管从冰箱里取出，用离心机在设定的转速为3500rpm,离心10min,将要测酶活力的的编号的上清液倒入另一干净的试管中。沉淀留下。（2）离心管中加入蒸馏水5ml轻微震荡制成悬浮液。（3）将悬浮液加到比色皿中，测其吸光度值。测定的OD600值填入下表根据数据绘制一张以培养时间(h)为X轴，以吸光度值OD600为Y轴的生长曲线。4.6样品吸光度值的测定（1）待测液的制备：选择编号为0、3、6、9、12、16，对应培养时间为0、6、12、18、24、32h的离心管，离心之后的上清液，即为待测酶液。（1）将酪素、三氯乙酸溶液放入40±0.2°C恒温水浴锅中，预热5min。（3）按下表操作：试管A（空白）试管B（酶试样，需作三测量平行）加酶液1.00mL加酶液1.00mL40±0.2°C，2min40±0.2°C，2min加三氯乙酸2.00mL（摇匀）加酪素1.00ml（摇匀）40±0.2°C，10min40±0.2°C，10min加酪素1.00ml（摇匀）加三氯乙酸2.00mL（摇匀）取出静止10min，过滤取出静止10min，过滤取1.00mL滤液取1.00mL滤液加碳酸钠溶液5.0mL加碳酸钠溶液5.0mL加福林酚试剂1.00mL加福林酚试剂1.00mL编号对照01234567891011发酵时间(h)0246810121416182022光密度值OD600编号12131415161718192021222324发酵时间(h)24262830323436384042444648光密度值OD60040±0.2°C显色20min40±0.2°C显色20min于680nm波长，用10mm比色皿于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度测其吸光度将测定的OD680值填入下表5.计算：X=A×K×4/10×nX——样品的酶活力，U/mL；A——样品平行试验的平均吸光度；K——吸光常数；4——反应试剂的总体积，mL；10——反应时间10min，以1min计；n——稀释倍数。所得结果表示至整数。5.1绘制酶活性曲线绘制一张次以培养时间（h）为X轴，吸光度值OD680为Y轴的酶活力曲线。6.实验结论与误差分析编号培养时间（h）蒸馏水调零对照组OD680值测定三次OD680值平均值样品OD680值