试验3-酵母活体染色观察及死亡率的测定

试验酵母形态的观察及细胞总数、出芽率和死亡率一、目的要求1、明确血球计数板计数的原理2、掌握测定酵母细胞总数、出芽率和死亡率的技术二、实验原理镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(PetroffHausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。血球计数扳的构造血球计数板计数网的分区和分格三、实验器材啤酒酵母菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，电吹风，盖玻片，接种环，0.1%吕氏美蓝染色液。四、方法步骤1、菌悬液的制备为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5-10个酵母宜，可采用10倍系列稀释法。2、镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。如有污物，则需清洗，用点吹风吹干后才能进行计数。3、加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。样品要均匀充满计数室，不可有气泡。4、显微镜计数加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍物镜寻找计数室的位置，然后换成高倍物镜（40倍）进行计数。显微镜视野中的光线要暗一些，否则，不容易看清计数室的方格线。计数时，对位于线上的酵母菌，可采取只计数两条边的办法，即遵循查上不查下，查左不查右的原则。当酵母菌芽体达到母细胞大小1/2时，即可计作两个细胞。5、出芽率的测定按前法，测定出酵母菌芽体数（小于母细胞1/2的），计算出单位体积内测得酵母菌细胞的芽体占总数的百分率，即为酵母菌的出芽率。6、酵母死亡率的测定滴一滴0.1%吕氏美蓝液于载玻片中央，再用接种环取酵母菌液少许，与染液混匀，染色2–3min，加盖玻片，立即镜检，计数在一个视野中，以变蓝（死）和未变蓝（活）的细胞数。依法再计数2-3个视野中的细胞数。死细胞数死亡率=×100%细胞总数1ml死亡率是单位体积内死亡的细胞数占总细胞数的百分率。7、计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或电吹风吹干。五、结果与思考1、将结果添入下表次数12平均值中方格序号细胞数芽体数细胞数/ml芽体数/ml出芽率2、根据你的实验体会，说明用血球计数板进行微生物计数时，其误差来自哪些方面？如何避免？·